Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae celloedd canser wedi esblygu amrywiol fecanweithiau i oresgyn straen cellog a pharhau i symud ymlaen.Protein kinase R (PKR) a'i ysgogydd protein (PACT) yw'r ymatebwyr cychwynnol sy'n monitro signalau straen amrywiol sy'n arwain at atal amlhau celloedd ac apoptosis.Fodd bynnag, mae rheoleiddio'r llwybr PACT-PKR mewn celloedd canser yn parhau i fod yn anhysbys i raddau helaeth.Yma, canfuom fod RNA di-godio hir (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) yn ymwneud yn uniongyrchol ag atal y llwybr PACT-PKR ac yn hyrwyddo amlhau celloedd canser.Gan ddefnyddio sgrinio swyddogaethol ar raddfa fawr o lncRNA sy'n gysylltiedig â chanser CRISPRi 971, canfuom fod DARS-AS1 yn gysylltiedig ag amlhau celloedd canser llawer gwell.Felly, mae knockout DARS-AS1 yn atal amlhau celloedd ac yn hyrwyddo apoptosis celloedd canser mewn amrywiol linellau celloedd canser in vitro ac yn lleihau twf tiwmor mewn vivo yn sylweddol.Yn fecanyddol, mae DARS-AS1 yn clymu'n uniongyrchol â'r parth actifadu PACT ac yn atal rhyngweithio PACT-PKR, a thrwy hynny leihau actifadu PKR, ffosfforyleiddiad eIF2α, ac atal marwolaeth celloedd apoptotig.Yn glinigol, mae DARS-AS1 wedi'i fynegi'n eang mewn canserau lluosog, ac mae gorfynegiant yr lncRNA hwn yn arwydd o brognosis gwael.Mae'r astudiaeth hon yn egluro rheoleiddio canser-benodol o'r llwybr PACT-PKR gan DARS-AS1 lncRNA ac yn darparu targed arall ar gyfer prognosis a thriniaeth canser.
Mae'r gallu i addasu i straen yn nodwedd bwysig o oroesiad celloedd canser ac amlhau.Mae amlhau cyflym a nodweddion metabolaidd canser yn cyrraedd uchafbwynt mewn micro-amgylcheddau llym - amddifadedd maetholion, hypocsia, a pH isel - a all sbarduno llwybrau signalau marwolaeth celloedd.Mae dadreoleiddio genynnau sy'n sensitif i straen fel p535, proteinau sioc gwres 6, 7, KRAS8, 9, a HIF-110, 11, 12, 13 i'w weld yn aml mewn canser, gan rwystro apoptosis a hyrwyddo goroesiad.
Mae Protein kinase R (PKR) yn synhwyrydd straen pwysig ac yn is-uned kinase o ffactor cychwyn ewcaryotig 2α (eIF2α), rheolydd trosiadol sy'n cysylltu straen cellog â marwolaeth celloedd.Yn wreiddiol, nodwyd PKR fel protein gwrthfeirysol trwy ganfod RNA llinyn dwbl tramor (dsRNA).Ar ôl ei actifadu, mae ffosfforyleiddiad PKR eIF2α i atal synthesis protein firaol a cellog14,15,16.Mae PACT (protein actifadu PKR) wedi'i nodi fel y protein actifadu PKR cyntaf yn absenoldeb dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Trwy ryngweithio uniongyrchol â PKR, mae PACT yn trosglwyddo straen amrywiol (newyn serwm, perocsid neu driniaeth arsenit) i PKR a llwybrau signalau i lawr yr afon.Yn ogystal â ffosfforyleiddiad eIF2α, mae actifadu PKR wedi'i gyfryngu gan PACT yn sbarduno digwyddiadau amrywiol sy'n gysylltiedig â'r ymateb i straen, gan gynnwys newid statws rhydocs trwy'r llwybr PI3K/Akt24, gwirio difrod DNA gwell trwy p5325,26 a NF-κB27,28 yn rheoleiddio trawsgrifiad, 29. O ystyried eu rôl hanfodol mewn ymateb i straen, ymlediad, apoptosis a phrosesau cellog allweddol eraill, mae PKR a PACT yn dargedau therapiwtig addawol ar gyfer llawer o afiechydon, yn enwedig canser30,31,32,33.Fodd bynnag, er gwaethaf yr arwyddocâd swyddogaethol a biolegol pleiotropig hwn, mae rheoleiddio gweithgaredd PACT/PKR mewn celloedd canser yn parhau i fod yn anodd dod o hyd iddo.
Mae lncRNAs yn drawsgrifiadau sy'n fwy na 200 niwcleotidau heb unrhyw botensial codio protein.Gan fod prosiectau dilyniannu genom cyfan blaengar wedi nodi miloedd o lncRNAs,35,36 gwnaed llawer o ymdrech i egluro eu swyddogaethau biolegol.Mae corff cynyddol o ymchwil wedi dangos bod lncRNAs yn ymwneud â llawer o brosesau biolegol37 gan gynnwys rheoleiddio anactifadu X-cromosomau38,39, argraffu40, trawsgrifio41,42, cyfieithu43 a hyd yn oed twf canser44,45,46,47.Nododd yr astudiaethau hyn fod llawer o lncRNAs yn rhan o'r llwybr PACT/PKR.Dangosodd un astudiaeth o'r fath fod lncRNA ASPACT yn atal trawsgrifio PACT a chynyddu cadw niwclear PACT mRNA.Mae astudiaethau eraill wedi dangos bod lncRNA nc886 yn clymu i PKR ac yn atal ei ffosfforyleiddiad49,50.Hyd yn hyn, nid yw lncRNA sy'n rheoleiddio actifadu PKR trwy gyfrwng PACT wedi'i adrodd.
Mae aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) wedi'i nodi fel lncRNA51,52,53,54 oncogenig.Trwy reoleiddio miP-194-5p53, miP-12952 a miP-532-3p51, dangoswyd bod DARS-AS1 yn hyrwyddo twf carcinoma celloedd arennol celloedd clir, carcinoma thyroid a charsinoma ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach, yn y drefn honno.Canfu Tong a chydweithwyr hefyd fod DARS-AS1 yn hyrwyddo dilyniant myeloma trwy gynnal sefydlogrwydd y motiff rhwymo RNA protein 39 (RBM39).Fodd bynnag, ni chynhaliwyd unrhyw astudiaethau i weld a yw'r lncRNA hwn yn ymwneud â rheoleiddio actifadu PACT-PKR ac ymateb straen celloedd canser.
Yma, fe wnaethom berfformio sgrin colli swyddogaeth ar raddfa fawr gan ddefnyddio system CRISPRi a phenderfynu bod lncRNA DARS-AS1 yn hyrwyddo amlhau sawl math o gelloedd canser.Yn ogystal, rydym wedi nodi mecanwaith mawr: mae DARS-AS1 yn rhwymo'n uniongyrchol i PACT, yn atal rhwymiad PACT a PKR, yn atal ffosfforyleiddiad eIF2α, swbstrad PKR is, ac yn y pen draw yn atal marwolaeth celloedd apoptotig.I gloi, mae ein gwaith yn datgelu lncRNA DARS-AS1 fel rheolydd y llwybr PACT-PKR a tharged posibl ar gyfer triniaeth canser a phrognosis.
Mae astudiaethau proffilio genomig helaeth wedi nodi cannoedd o lncRNAs sy'n gysylltiedig â chanser.Fodd bynnag, mae eu swyddogaeth yn parhau i fod yn anhysbys i raddau helaeth56.Er mwyn nodi ymgeiswyr lncRNA addawol sy'n ymwneud â dilyniant canser, gwnaethom berfformio sgrin colli swyddogaeth ar gyfer llai o amlhau yn llinell gell canser y colon a'r rhefr SW620 gan ddefnyddio system CRISPRi (Ffig. 1a).Nodwedd unigryw llinellau celloedd canser y colon SW480 a SW620 yw eu bod yn deillio o diwmorau cynradd ac eilaidd mewn un claf.Mae hyn yn darparu cymhariaeth werthfawr ar gyfer astudio newidiadau genetig yn natblygiad canser datblygedig y colon.Felly, dadansoddwyd trawsgrifiadau llinellau celloedd canser y colon a'r rhefr (SW480 a SW620) gan ddefnyddio dilyniannu RNA a chasglwyd rhai lncRNAs swyddogaethol posibl o'r llenyddiaeth gyhoeddedig.Yn seiliedig ar y canlyniadau hyn, fe wnaethom gynllunio llyfrgell sgRNA gyfun yn cynnwys 7355 oligos sgRNA yn targedu 971 o lncRNAs sy'n gysylltiedig â chanser a 500 oligos sgRNA heb eu targedu ar gyfer rheolaeth negyddol (Data Atodol 1).
Cynrychioliad sgematig o sgrinio gan ddefnyddio system CRISPRi.b cyfoethogi sgRNA ar ôl sgrinio.Mae'r llinell lorweddol ddotiog yn cynrychioli log2 (newid plyg) = ±0.58.Mae'r llinell ddotiog fertigol yn dynodi gwerth p = 0.05.Mae dotiau du yn cynrychioli sgRNA nad yw'n darged (a ddynodwyd yn NC).Mae dotiau coch yn sgRNAs sy'n targedu DARS-AS1.Mae dotiau glas yn sgRNAs sy'n targedu LINC00205, lncRNA oncogenig a ddisgrifiwyd yn flaenorol.newid plyg = (darllen wedi'i normaleiddio, diwrnod 17)/ (darllen wedi'i normaleiddio, diwrnod 0).c Roedd dymchweliad sgRNA DARS-AS1 yn atal twf celloedd.Mae bariau gwall yn cynrychioli ± gwyriad safonol y tri arbrawf.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 prawf-t Myfyriwr dwy gynffon.d Mynegiant DARS-AS1 mewn tiwmorau (set ddata TCGA).em Mynegi DARS-AS1 mewn samplau normal a thiwmor mewn parau gan gleifion â BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, a COAD, yn y drefn honno (set ddata TCGA).cafwyd gwerthoedd-p gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr dwy gynffon pâr.
Ar ôl adeiladu'r plasmid a phecynnu'r lentivirus, fe wnaethom drosglwyddo llinell gell canser y colon a'r rhefr dCas9-SW620 gyda'r llyfrgell uchod mewn pedwar arbrawf haint annibynnol.Roedd lluosogrwydd yr heintiad (MOI) ar gyfer yr heintiau hyn yn 0.1-0.3, sy'n dangos mai dim ond gydag un sgRNA y gellir trosi pob cell.Ar ôl 18 diwrnod o ddiwylliant in vitro, gostyngodd neu gynyddodd proffil cyfoethogi sgRNAs targed ar ôl sgrinio, tra bod nifer yr oligonucleotides rheoli heb ei dargedu wedi aros yn gymharol ddigyfnewid o'i gymharu â'r proffil cyn sgrinio, sy'n dangos bod gan ein targed sgrin benodol iawn. llyfrgell.Reis.1b a thabl atodol 1). Cafodd LINC00205, yr adroddwyd yn flaenorol ei fod yn hybu canser yr ysgyfaint a dilyniant canser yr afu58,59,60, ei sgrinio allan (log2 (plygnewid) < −0.58, gwerth p < 0.05), gan gadarnhau dibynadwyedd y sgrinio hwn (Ffig. 1b). Cafodd LINC00205, yr adroddwyd yn flaenorol ei fod yn hybu canser yr ysgyfaint a dilyniant canser yr afu58,59,60, ei sgrinio allan (log2 (plygnewid) < −0.58, gwerth p < 0.05), gan gadarnhau dibynadwyedd y sgrinio hwn (Ffig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Cafodd LINC00205, yr adroddwyd yn flaenorol ei fod yn hyrwyddo dilyniant canser yr ysgyfaint a chanser yr afu58,59,60, ei eithrio (log2 (newid plyg) <-0.58, p-value <0.05), gan gadarnhau cadernid y sgrinio hwn (Ffig. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（log2 （倍数 变化）） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， ， 证实 证实 了 该 该 筛选 的 可靠性））））））））。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））））） Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（log2 （倍数 变化）） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， ， 证实 证实 了 该 该 筛选 的 可靠性））））））））。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））））） LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Cafodd LINC00205, yr adroddwyd yn flaenorol ei fod yn hyrwyddo dilyniant canser yr ysgyfaint a'r afu58,59,60, ei eithrio (log2 (newid plyg) <-0.58, p-gwerth <0.05), gan gadarnhau cadernid y sgrinio hwn (Ffig. .1b).
Ymhlith yr holl lncRNAs a brofwyd, cafodd DARS-AS1 ei sgrinio hefyd, gyda'r tri oligonucleotides sgRNA cytras wedi lleihau'n sylweddol ar ôl 18 diwrnod o ddiwylliant, sy'n awgrymu bod dymchwel yr lncRNA hwn wedi arwain at leihad mewn canser (Ffig. 1b).Ategwyd y canlyniad hwn ymhellach gan ddadansoddiad MTS mewn celloedd canser y colon a'r rhefr a ddangosodd mai dim ond haneru o'i gymharu â chelloedd rheoli (Ffigur 1c) oedd cyfradd twf celloedd canser y colon a'r rhefr o gymharu â chelloedd rheoli (Ffigur 1c) a'i fod yn gyson ag adroddiadau blaenorol sawl math arall o ganser.: canser yr arennau celloedd clir, canser y thyroid a chanser yr ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach51,52,53,55.Fodd bynnag, mae ei swyddogaeth a'i fecanweithiau moleciwlaidd mewn canser colorefrol yn parhau heb eu harchwilio.Felly, dewisom yr lncRNA hwn ar gyfer astudiaeth bellach.
I astudio mynegiant DARS-AS1 mewn cleifion, dadansoddwyd yn gynhwysfawr 10,327 o samplau tiwmor o'r prosiect Atlas Genom Canser (TCGA).Mae ein canlyniadau'n dangos bod DARS-AS1 yn cael ei fynegi'n eang a'i uwchreoleiddio'n sylweddol mewn celloedd iach mewn amrywiaeth o diwmorau, gan gynnwys adenocarcinoma'r colon (COAD), carcinoma celloedd clir arennol (KIRC), a charsinoma celloedd papilari arennol (KIRP)..Ychydig iawn (Ffig. 1d a Ffig. Atodol 1a, b). Cadarnhaodd dadansoddiad o samplau iach/tiwmor mewn parau ymhellach fynegiant sylweddol uwch o DARS-AS1 yn y tiwmorau o garsinoma wrothelial y bledren (BLCA), carsinoma celloedd clir arennol yr arennau (KIRC), adenocarcinoma y prostad (PRAD), carsinoma celloedd cennog yr ysgyfaint (LUSC) , carsinoma endometrial corpws crothol (UCEC), adenocarsinoma yr ysgyfaint (LUAD), carsinoma hepatogellog yr iau (LIHC), carsinoma celloedd papilari arennol yr arennau (KIRP), ac adenocarsinoma'r colon (COAD) (gwerth p < 0.05) (Ffig. 1e–m) . Cadarnhaodd dadansoddiad o samplau iach/tiwmor mewn parau ymhellach fynegiant sylweddol uwch o DARS-AS1 yn y tiwmorau o garsinoma wrothelial y bledren (BLCA), carsinoma celloedd clir arennol yr arennau (KIRC), adenocarcinoma y prostad (PRAD), carsinoma celloedd cennog yr ysgyfaint (LUSC) , carsinoma endometrial corpws crothol (UCEC), adenocarsinoma yr ysgyfaint (LUAD), carsinoma hepatogellog yr iau (LIHC), carsinoma celloedd papilari arennol yr arennau (KIRP), ac adenocarsinoma'r colon (COAD) (gwerth p < 0.05) (Ffig. 1e–m) .Cadarnhaodd dadansoddiad o samplau iach/tiwmor mewn parau hefyd fynegiant sylweddol uwch o DARS-AS1 mewn carsinoma wrothelial y bledren (BLCA), carcinoma celloedd arennol ac arennol clir (KIRC), adenocarcinoma y prostad (PRAD), tiwmorau carcinoma celloedd cennog yr ysgyfaint (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , carcinoma endometrial y corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma yr ysgyfaint (LUAD), carcinoma hepatocellular yr afu (LIHC), carcinoma celloedd papilari yr aren (KIRP), ac adenocarcinoma y colon (COAD) (gwerth p < 0.05) (Ffig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-AS1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA) 、 肾 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 肿瘤 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， ch <0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 前列 前列 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 、 、 、 、 、 、 、 、 、 (lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 高 表达 ， 内膜 癌 （（（（） 肺腺癌 （（luad） 肝肝 肝肝 细胞癌 （（（lihc） 肾 肾 乳头状 细胞 细胞癌 (kirp) (cod) (p 值<0.05）（图1e-m) .Roedd dadansoddiad o samplau pâr iach/tiwmor yn ategu ymhellach rôl DARS-AS1 mewn carsinoma wrothelial y bledren (BLCA), carcinoma celloedd arennol clir (KIRC), adenocarcinoma y prostad (PRAD), a thiwmorau carcinoma celloedd cennog yr ysgyfaint (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). mynegiant mewn carcinoma corpws groth (UCEC), adenocarcinoma ysgyfaint (LUAD), carcinoma hepatocellular (LIHC), carcinoma celloedd papilari arennol (KIRP), ac adenocarcinoma colon (COAD) (gwerth p <0.05) (Ffigur 1e -m).Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod DARS-AS1 wedi'i fynegi'n eang ac yn uchel mewn amrywiaeth o ganserau.
Gan fod DARS-AS1 a DARS (y genyn sy'n amgodio'r llinyn antisense) yn rhannu'r un hyrwyddwr ac wedi'u lleoli wrth ymyl ei gilydd, fe wnaethom gynllunio shRNA i ddymchwel DARS-AS1 yn benodol ond nid DARS (Ffig Atodol 2a,b a Thabl Atodol 2 ) .Yn ogystal â SW620, gwnaethom hefyd ddefnyddio tair llinell gell arall sy'n mynegi DARS-AS1 yn uchel i astudio effeithiolrwydd a swyddogaeth dymchweliad shRNA (Tabl Atodol 3).Dangosodd ein canlyniadau fod y tri shRNA a ddatblygwyd wedi cyflawni o leiaf 80% o effeithlonrwydd dymchweliad DARS-AS1 heb fawr o effaith ar faint o mRNA DARS (Ffig Atodol 2c-f).Yn ogystal, canfuom fod dymchweliad DARS-AS1 gyda'r shRNAs hyn yn atal twf celloedd yn sylweddol mewn llinellau celloedd canser colorectol SW620 (49.7%) a HCT116 (27.7%), llinell gell canser y fron MBA-MD-231 (53.4%).) a llinell gell hepatoma HepG2 (gostyngiad o 92.7%), yn ogystal â'u gallu i ffurfio sfferau heb eu hangori (gostyngiad cyfartalog o ~50.8%, 44.6%, 40.7% a 75.7% fesul llinell gell) (Ffig. 2a,b).Yn SW620, cadarnhaodd canlyniadau'r asesiad ffurfio cytref ymhellach fod DARS-AS1 shRNA yn atal amlhau celloedd yn sylweddol gyda gostyngiad cyfartalog o tua 69.6% (Ffig. 2c).
Effaith shRNA rheoli a DARS-AS1 shRNA ar amlhau celloedd (a) a ffurfio spheroid (b) mewn celloedd SW620, HCT116, MBA-MD-231, a HepG2.c Effaith shRNA rheoli a shRNA DARS-AS1 ar ffurfiant cytrefi mewn celloedd SW620.Ymlediad celloedd (d), ffurfiant sfferoid (e), a ffurfiant cytref (f) o gelloedd SW620 yn gorfynegi DARS-AS1.Y data a ddangosir yw gwyriad safonol cymedrig ± tri arbrawf.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ac *** p ≤ 0.001 gan brawf-t Myfyriwr dwy gynffon.
I gyd-fynd ag astudiaethau colli swyddogaeth, fe wnaethon ni greu celloedd SW620 yn gorfynegi DARS-AS1 (Ffig Atodol 2g).Cynyddodd gorfynegiant DARS-AS1 dwf celloedd yn sylweddol (1.8-plyg), ffurfiant sfferoid heb ei angori (1.4-plyg), a ffurfiant cytref (3.3-plyg) mewn celloedd SW620 (Ffig. 2d–f).Gwnaethom gadarnhau'r canlyniad hwn gan ddefnyddio llinell gell fynegi DARS-AS1 arall, A549.Gwelwyd yr ymlediad celloedd uwch hwn oherwydd gorfynegiant DARS-AS1 ymhellach yng nghelloedd A549 (Ffig Atodol 2h, i a Thabl Atodol 3).Gyda'i gilydd, mae'r astudiaethau enillion a cholled hyn yn dangos bod DARS-AS1 yn hyrwyddo amlhau celloedd canser in vitro.
Er mwyn archwilio'r mecanwaith sylfaenol y mae DARS-AS1 yn ei ddefnyddio i reoleiddio amlhau celloedd, gwnaethom gynnal dadansoddiad tynnu i lawr RNA i nodi ei bartneriaid rhwymo protein posibl.Dangosodd canlyniadau RT-qPCR fod tua 86.2% o DARS-AS1 wedi'i leoli yn cytoplasm celloedd SW620 (Ffig Atodol 3a).Yna deorwyd y DARS-AS1 neu ffug-AS1 biotinylated biotinylated in vitro â lysates celloedd SW620 ac yna gwahaniad SDS-PAGE.Dangosodd staenio arian dilynol fod band gwahanol (~38 kDa) wedi'i gyfoethogi'n sylweddol mewn samplau tynnu DARS-AS1 ond nid mewn samplau RNA ffug neu gleiniau (Ffig. 3a).Nodwyd y band hwn fel protein actifadu PKR (PACT) gan sbectrometreg màs (MS) a'i gadarnhau ymhellach gan imiwnoblotio yn llinellau celloedd SW620, HCT116, a HepG2 (Ffig. 3a,b).Ymchwiliwyd hefyd i gyfoethogi DARS a phroteinau PACT cysylltiedig - PKR a TRBP - gan ddefnyddio dadansoddiad RNA gan blotio Gorllewinol (WB).Dangosodd y canlyniadau na ddarganfuwyd unrhyw ryngweithio uniongyrchol rhwng DARS-AS1 RNA a'r tri phrotein hwn (Ffig Atodol 3b).Cadarnhawyd y rhyngweithio penodol rhwng DARS-AS1 a PACT ymhellach gan ddadansoddiad imiwnodiad RNA (RIP), a ddangosodd fod DARS-AS1 wedi'i gyfoethogi'n sylweddol mewn gwrthgyrff gwrth-PACT ond nid RNAS rheoli eraill (Ffigur 3c).I benderfynu a yw DARS-AS1 yn rhyngweithio'n uniongyrchol â PACT yn absenoldeb unrhyw gydrannau cellog eraill, perfformiwyd assay interferometreg biohaenog in vitro (BLI) gan ddefnyddio PACT wedi'i buro.Cafodd DARS-AS1 neu RNA ffug gyda label biotin ei atal rhag symud ar fiosynwyryddion streptavidin (SA) ac yna'i ddeor mewn byffer cinetig yn cynnwys 1 μM PACT.Yn nodedig, roedd PACT wedi'i rwymo'n gryf i DARS-AS1 (gwerth KD ~26.9nM), ond nid i ddynwared RNA (Ffigur 3d).Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos rhyngweithio uniongyrchol ac affinedd uchel rhwng DARS-AS1 a PACT.
Nododd dadansoddiad tynnu RNA fod DARS-AS1 yn rhyngweithio â PACT mewn celloedd SW620.Uchod, staenio arian o broteinau cysylltiedig.Perfformiwyd imiwnoblotiau is gyda gwrthgorff gwrth-PACT.b Perfformiwyd dadansoddiad tynnu i lawr RNA yng nghelloedd HCT116 (top) a HepG2 (gwaelod).Canfuwyd cyfoethogi PACT gan imiwnoblotting.Perfformiwyd profion imiwnodiad cRNA (RIP) mewn celloedd SW620 gan ddefnyddio'r gwrthgyrff a nodwyd.d Cafwyd cromliniau rhwymo PACT i DARS-AS1 hyd llawn neu RNA rheoli gan ddefnyddio interferometreg biohaen (BLI).Cafodd RNA ei atal rhag symud ar fiosynhwyrydd streptavidin.Defnyddiwyd 1 μM PACT i fesur cysylltiad.e Perfformiwyd assay tynnu RNA gan ddefnyddio DARS-AS1 hyd llawn biotinylated neu wedi'i gwtogi (brig).Immunoblot yn dangos PACT a dderbyniwyd (gwaelod).f Deorwyd PACT wedi'i fflagio wedi'i buro â DARS-AS1 hyd llawn biotinylated neu ei gwtogi (fel yn e) ar gyfer assay RIP in vitro.Dilyswyd yr RNA a echdynnwyd gan RT-qPCR.g Cafwyd affinedd cymharol gwahanol ddarnau RNA ar gyfer PACT gan ddefnyddio interferometreg biohaenog.Ar gyfer dadansoddi, defnyddiwyd 100 nM RNA ac 1 μM RAST.h Cynhaliwyd profion RIP in vitro gan ddefnyddio PACT wedi'i buro'n gyfan neu wedi'i gwtogi â'r label.Dilyswyd yr RNA a echdynnwyd gan RT-qPCR.i Cyfradd twf celloedd SW620 yn gorfynegi DARS-AS1, PACT, neu'r ddau.j Cafodd gorfynegiant o DARS-AS1 hyd llawn neu chwtogi mewn celloedd SW620 effeithiau gwahanol ar dwf celloedd.k Canfuwyd apoptosis trwy imiwnoblotting gyda gwrthgorff gwrth-PARP.l Mae Knockout o DARS-AS1 yn achosi apoptosis o gelloedd SW620 fel y dangosir gan sytometreg llif.Y data a ddangosir yw gwyriad safonol cymedrig ± tri arbrawf. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, gan brawf t Myfyriwr dwy gynffon. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, gan brawf t Myfyriwr dwy gynffon. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 gan brawf-t Myfyriwr dwy gynffon. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 gan brawf-t Myfyriwr dwy gynffon.
Yna fe wnaethom gynhyrchu tri darn RNA DARS-AS1 biotinylated trwy drawsgrifiad in vitro i nodi'r rhanbarth DARS-AS1 sy'n ofynnol ar gyfer cysylltiad PACT (Ffigur 3e).Mae'r canlyniadau dadansoddiad RNA yn dangos bod pob darn yn gallu rhyngweithio â PACT, ond mae'r rhanbarth 3 '-terminal (384-768 niwcleotidau labelu A3) yn dangos mwy na 1-384 niwcleotidau labelu A1) ( Ffig. 3e ).Gwelwyd canlyniadau tebyg yn y assay RIP in vitro gan ddefnyddio PACT ailgyfunol (Ffigur 3f).Yn gyson â'r canlyniadau hyn, dangosodd arbrofion i rwymo darnau RNA ansymudol i PACT gan ddefnyddio BLI hefyd fod gan PACT affinedd uwch ar gyfer A3 (384-768 nt) (gwerth KD o tua 94.6 nm), tra bod bron dim cysylltiadau ag ardaloedd eraill.(Ffig. 3d).
Fe wnaethom hefyd archwilio'r rhanbarthau rhwymol cysylltiedig yn PACT.Mae PACT yn cynnwys tri pharth swyddogaethol, dau ohonynt yn barthau rhwymo RNA dwy-sownd cadw (dsRBD) a thrydydd parth (dynodedig D3) sy'n gweithredu fel ysgogydd rhyngweithiadau protein.I archwilio cynhwysedd rhwymo lncRNA pob parth, fe wnaethom beiriannu tri threiglad a oedd yn dileu pob un o'r tri pharth ac yn perfformio assay RIP in vitro.Dangosodd ein canlyniadau fod dileu trydydd parth (D3) PACT wedi lleihau ei ryngweithio â DARS-AS1 yn sylweddol (0.11-plyg o'i gymharu â PACT cyfan) o'i gymharu â'r ddau dreiglad arall (Ffig. 3h), dangoswyd bod y datganiad o D3 yn rhyngweithio â DARS.-AC1.Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall rhyngweithio rhwng DARS-AS1 a PACT ddigwydd yn bennaf trwy ddiwedd 3′ DARS-AS1 a pharth D3 PACT.
Gwnaethom nodi nad oedd DARS-AS1 yn cael unrhyw effaith ar fynegiant PACT ac nid oedd gan PACT unrhyw effaith ar DARS-AS1 (Ffig Atodol 3c).Yna fe wnaethom archwilio effaith dymchweliad PACT ar dwf celloedd.Mewn cyferbyniad â DARS-AS1, tyfodd celloedd cymharol 1.5-3 gwaith yn gyflymach pan gafodd PACT ei ddymchwel (Ffig Atodol 3d).Mae canlyniadau'r assay ffurfio nythfa yn dangos bod y celloedd yn ffurfio cytrefi 2-3-plyg ar ôl triniaeth shRNA gyda PACT (Atodol Ffig. 3e).Er mwyn profi a yw DARS-AS1 yn rheoleiddio amlhau celloedd trwy PACT, gwnaethom gynhyrchu celloedd SW620 gan or-fynegi PACT, DARS-AS1, neu'r ddau.Roedd gorfynegiant PACT yn dangos ataliad sylweddol o amlhau celloedd (Ffigur 3i).Er bod gorfynegiant DARS-AS1 fel y cyfryw yn hyrwyddo amlhau celloedd yn sylweddol, nid oedd gwahaniaeth arwyddocaol yng nghyfradd twf celloedd a oedd yn gorfynegi DARS-AS1 a PACT.Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai PACT wrthweithio'r cynnydd yn yr ymlediad a achosir gan orfynegiant DARS-AS1.
Gan fod gan wahanol ranbarthau DARS-AS1 alluoedd rhwymo PACT gwahanol, fe wnaethom ymchwilio i'w dylanwad cymharol ar amlhau celloedd trwy or-fynegiant gwahanol o ddarnau DARS-AS1.O'i gymharu â'r ddau ddarn arall, gorfynegwyd DARS-AS1 ar ddiwedd 3′ (384-768 nt), y prif ranbarth cysylltiedig â PACT yn DARS-AS1, a oedd â'r gallu uchaf i ysgogi amlhau celloedd (Ffig. 3j).Mae'r canlyniadau hyn yn dangos cydberthynas gadarnhaol rhwng gallu rhwymo a swyddogaeth fiolegol DARS-AS1.
Adroddwyd bod PACT yn brotein pro-apoptotig19.Felly, gwnaethom ymchwilio i effaith DARS-AS1 ar apoptosis.Yn ôl y disgwyl, cynyddodd dymchweliad DARS-AS1 yn sylweddol holltiad PARP mewn celloedd SW620 a chynyddodd cyfran y celloedd V-positif anecsin yn llinellau celloedd SW620, HCT116, HepG2, a MBA-MD-231 (Ffig. 3k).3).3f–h), sy'n nodi bod effaith gwrth-apoptotig DARS-AS1 mewn celloedd canser yn groes i swyddogaeth ysgogi apoptosis PACT.Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai mecanwaith swyddogaeth oncogenig DARS-AS1 fod trwy atal swyddogaeth PACT.
Nesaf, buom yn archwilio goblygiadau swyddogaethol y gymdeithas DARS-AS1-PACT.Adroddwyd bod PACT yn actifadu PKR trwy ryngweithio uniongyrchol, sydd wedyn yn gwella ffosfforyleiddiad eIF2α, gan achosi dileu trosiadol ac apoptosis17.Yn gyntaf, gwnaethom archwilio a yw DARS-AS1 yn effeithio ar leoleiddio cellog PACT a PKR.Dangosodd microsgopeg fflworoleuedd confocal fod PACT a PKR wedi'u cydleoli'n fawr mewn celloedd SW620 gyda chyfernod cydberthynas Pearson cyfartalog o 0.72.Yn y cyfamser, gostyngodd gorfynegiant DARS-AS1 yn sylweddol gydleoli PACT a PKR (cyfernod cydberthynas cymedrig Pearson 0.61) (Ffigur 4a).Er mwyn ymchwilio i weld a allai DARS-AS1 fodiwleiddio'r rhyngweithiad PACT-PKR, gwnaethom gynnal assay cyd-imiwnedd (cyd-IP) gyda gwrthgorff gwrth-PACT mewn lysadau celloedd SW620.Roedd PKR wedi'i gyfoethogi'n fawr mewn gwrth-PACT mewn celloedd rheoli, tra bod adferiad PKR wedi'i leihau'n sylweddol mewn lysadau o gelloedd yn gorfynegi DARS-AS1 (Ffig. 4b).Defnyddiwyd PACT a PKR wedi'u labelu wedi'u puro ar gyfer profion rhwymo protein in vitro.Yn unol â hynny, roedd y rhai a ddarparodd DARS-AS1 ond dim RNA rheolaeth yn dangos rhyngweithio PACT-PKR wedi'i atal (Ffigur 4c).Dangosodd yr holl ganlyniadau fod DARS-AS1 wedi amharu ar gyfathrebu PACT a PKR.
a sylwyd ar gydleoli PACT a PKR mewn celloedd rheoli neu gelloedd yn gorfynegi DARS-AS1 gan ddefnyddio microsgopeg fflworoleuedd confocal.Cafodd y cnewyllyn eu staenio â DAPI.Cafwyd canlyniadau ystadegol o 16 ffotograff.b Cyd-imiwnedd (cyd-IP) gan ddefnyddio gwrthgorff gwrth-PACT mewn cell lysates rheoli celloedd SW620 neu gelloedd gorfynegi DARS-AS1.c Deorwyd PACT wedi'i labelu, PKR puredig a thrawsgrifiwyd in vitro gyda DARS-AS1 neu RNA ffug ar gyfer dadansoddiad rhwymo protein in vitro.Defnyddiwyd gwrthgyrff gwrth-faner ar gyfer imiwnodiad.d Perfformiwyd imiwnoblots gyda'r gwrthgyrff a nodwyd yng nghelloedd SW620 a HCT116 a drawslifwyd â shRNA rheoli neu DARS-AS1-shRNA ac yna newyn serwm.d Newidiodd lefelau mynegiant DARS-AS1 sensitifrwydd cellog i thapsigargin.Trawsnewidiwyd celloedd SW620 â DARS-AS1 shRNA, plasmid gorfynegiant DARS-AS1 neu plasmid rheoli.Cafodd celloedd eu trin â thapsigargin am 48 awr a phennwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio'r adweithydd MTS.f Defnyddiwyd DARS-AS1 neu RNA ffug wedi'i drawsgrifio mewn vitro a PACT wedi'i buro ar gyfer assay activation in vitro a chanfod imiwnoblot.g Perfformiwyd imiwnoblots gan ddefnyddio'r gwrthgyrff hyn ar gelloedd SW620-ctrl (chwith) neu gelloedd yn gorfynegi mwtaniaid PKR (dde).Yna trosglwyddwyd y celloedd hyn â shRNA rheoli neu DARS-AS1-shRNA ac yna newyn serwm.h Dangosodd cytometreg llif fod anactifadu'r PKR mutant yn gwneud iawn am apoptosis a achosir gan DARS-AS1 mewn celloedd SW620.i Perfformiwyd imiwnoblots gyda'r gwrthgyrff a nodwyd yng nghelloedd SW620 (chwith) neu HCT116 (dde).Mae celloedd a drosglwyddir â shRNA rheoli neu shRNA DARS-AS1 yn amddifad o serwm ac yn cael eu hategu gan atalydd 100 nM PKR C16 neu DMSO.Bar graddfa = 5 µm.Y data a ddangosir yw gwyriad safonol cymedrig ± tri arbrawf.* p ≤ 0.05 prawf-t Myfyriwr dwy gynffon.
Credir yn gyffredinol, unwaith y bydd PACT yn rhyngweithio â PKR17, y gellir ysgogi ffosfforyleiddiad PKR yn Thr451.Dangosodd ein canlyniadau fod lefel ffosfforyleiddiad PKR wedi'i godi'n sylweddol yng nghelloedd dymchwel DARS-AS1 ar ôl newyn serwm (Ffig. 4d a Ffig. Atodol 4a).Yn unol â hynny, canfuom fod ffosfforyleiddiad eIF2α, y prif swbstrad PKR, hefyd wedi cynyddu'n sylweddol gan DARS-AS1 shRNA (Ffig. 4d a Ffig Atodol 4a).Mae Thapsigargin yn straen ER sy'n achosi i'r ER ryddhau Ca2+.Adroddwyd bod triniaeth â thapsigargin yn ysgogi mynegiant ac actifadu PACT, sy'n rhyngweithio ymhellach â PKR ac yn ei actifadu, gan arwain at apoptosis trwy gynyddu ffosfforyleiddiad eIF2α 18,61 .Yma, gwnaethom ddefnyddio thapsigargin fel ysgogydd y llwybr PACT / PKR i ymchwilio i weld a all DARS-AS1 helpu celloedd i oresgyn straen trwy atal y llwybr PACT / PKR.Gwelsom fod cydberthynas gadarnhaol rhwng lefel mynegiant DARS-AS1 ac ymwrthedd celloedd i thapsigargin.Goroesodd celloedd SW620 a oedd yn gorfynegi DARS-AS1 yn well pan gânt eu trin â thapsigargin, tra daeth celloedd â dymchweliad DARS-AS1 yn fwy agored (Ffig. 4e).Yn gyson â'r canlyniadau hyn, gostyngodd gorfynegiant DARS-AS1 ffosfforyleiddiad PKR a achosir gan thapsigargin (Ffig Atodol 4b).Mewn cyferbyniad, ar ôl triniaeth thapsigargin, cafodd PKR ac eIF2α eu ffosfforyleiddio i raddau uwch mewn celloedd dymchwel DARS-AS1 o gymharu â chelloedd rheoli (Ffig Atodol 4b).Yn ddiddorol, mae thapsigargin wedi achosi mynegiant DARS-AS1 mewn modd dibynnol ar ddos, a allai ddangos swyddogaeth gwrth-straen DARS-AS1 (Ffig Atodol 4c).Yn ogystal, gwnaethom gynnal profion actifadu in vitro i gadarnhau'r arsylwadau hyn.Yn gryno, cafodd PKR ei buro o lysadau celloedd gan ddefnyddio gwrthgorff gwrth-PKR, yna ei ddeor gyda PACT ailgyfunol a DARS-AS1 wedi'u trawsgrifio in vitro.Ar ôl yr adwaith ensymatig, canfuwyd phospho-PKR gan ddefnyddio WB.Dangosodd ein canlyniadau fod ffosfforyleiddiad PKR wedi'i atal yn sylweddol gan DARS-AS1, ond nid gan RNA rheoli (Ffigur 4f).Mae'r canlyniadau in vitro ac in vivo hyn yn awgrymu bod DARS-AS1 yn atal gweithrediad PKR trwy gyfrwng PACT.Ar yr un pryd, gwelsom hefyd ostyngiad mewn adferiad PACT ym mhresenoldeb DARS-AS1 (Ffigur 4f).Mae'r canlyniad hwn yn gyson â chanlyniadau'r assay rhwymo protein in vitro (Ffigur 4c) ac unwaith eto yn dangos swyddogaeth blocio DARS-AS1 ar gyfer cysylltiad PACT-PKR.
Mae angen Ser246 a Ser287 ym mharth D3 PACT ar gyfer actifadu PKR o dan straen cellog.Roedd amnewid dau weddillion serine am alanine yn rhoi PACT mutant (mutD), a ysgogodd PKR yn absenoldeb straen, ac amnewid alanine (mutA) i wrthdroi'r protocol.Gan ein bod wedi dangos pwysigrwydd y maes hwn mewn cysylltiad uniongyrchol â DARS-AS1, rydym wedi cynhyrchu'r ddau mutants PACT hyn i brofi a allai'r gweddillion hyn hefyd ymwneud â rhyngweithio â DARS-AS1.Yn ddiddorol, collodd y ddau mutants y gallu i rwymo i DARS-AS1 (Ffig Atodol 4d), gan awgrymu y gallai fod angen strwythur cyflawn y protein PACT ar gyfer rhyngweithio effeithlon â DARS-AS1.
Ymhellach, mae ein canlyniadau hefyd yn awgrymu y gall ataliad rhag amlhau celloedd a achosir gan DARS-AS1-shRNA gael ei adfer yn rhannol trwy or-fynegi mutant PACT negyddol dominyddol (PACTmutA) neu mutant PKR negyddol dominyddol (PKRmut) (Ffig Atodol 4e. e).Lleihaodd gorfynegiant o mutants PKR dominyddol-negyddol ffosfforyleiddiad PKR a achosir gan ddymchwel DARS-AS1 yn ogystal â ffosfforyleiddiad eIF2α mewn celloedd â serwm-amddifadedd (Ffig. 4g).Yn bwysicach fyth, gostyngwyd cyfran y celloedd apoptotig a achoswyd gan ddymchwel DARS-AS1 hefyd mewn celloedd a oedd yn gorfynegi PKRmut (Ffig. 4h a Ffig Atodol 4g).Mae atal gweithgaredd kinase PKR hefyd yn amharu ar swyddogaeth DARS-AS1, gan fod canlyniadau'n dangos mai anaml y byddai taro DARS-AS1 yn sbarduno ffosfforyleiddiad PKR ac eIF2α pan gafodd celloedd eu trin ag atalydd C16 PKR-benodol (Ffig. 4i a Ffig Atodol 4h).).Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n awgrymu bod DARS-AS1 yn hyrwyddo amlhau celloedd, yn rhannol o leiaf, trwy atal actifadu PKR wedi'i gyfryngu gan PACT.
Er mwyn archwilio ymhellach rôl DARS-AS1 mewn tumorigenesis, gwnaethom berfformio arbrofion in vivo gan ddefnyddio model xenograft llygoden. Dengys y canlyniadau fod dymchwel DARS-AS1 wedi lleihau twf tiwmor yn sylweddol mewn llygod (gwerth p < 0.0001) (Ffig. 5a). Dengys y canlyniadau fod dymchwel DARS-AS1 wedi lleihau twf tiwmor yn sylweddol mewn llygod (gwerth p < 0.0001) (Ffig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение 5,000). Mae'r canlyniadau'n dangos bod dymchweliad DARS-AS1 yn lleihau twf tiwmor yn sylweddol mewn llygod (gwerth p < 0.0001) (Ffigur 5a).结果表明，DARS-AS1的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（图5a）Dars-AS1; Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значен) значительно снижает рост опухоли у мышей (значен) (значен). Dangosodd y canlyniadau fod dymchweliad DARS-AS1 wedi lleihau twf tiwmor yn sylweddol mewn llygod (gwerth p < 0.0001) (Ffigur 5a).Felly, yn y grŵp dymchwel DARS-AS1, bu gostyngiad sylweddol mewn cyfaint tiwmor cymedrig tua 72.9% a màs cymedrig tiwmor tua 87.8% (Ffigur 5b-d).Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu'n gryf y gall DARS-AS1 hyrwyddo twf tiwmor mewn vivo yn sylweddol.
Effeithiau ad DARS-AS1 knockdown ar oncogenesis colorectol mewn llygod noethlymun.Dangosir cromliniau twf (a), maint tiwmor (b), pwysau (c), a delweddau tiwmor (d).Mae bariau gwall yn cynrychioli ±SEM. n = 10. ****p < 0.0001, gan brawf t Myfyriwr dwy gynffon. n = 10. ****p < 0.0001, gan brawf t Myfyriwr dwy gynffon. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 Prawf-t Myfyriwr dwy gynffon.n = 10. ****p < 0.0001, 通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001, 通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 prawf-t Myfyriwr dwy gynffon.e Dadansoddodd Kaplan-Meier y gydberthynas rhwng lefelau mynegiant DARS-AS1 a goroesiad cyffredinol cleifion â UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ac LGG.Roedd lefelau uchel o fynegiant DARS-AS1 mewn cleifion yn y 50% uchaf;roedd lefel isel mynegiant DARS-AS1 mewn cleifion yn y 50% isaf.pennwyd gwerthoedd-p gan ddefnyddio'r prawf rheng log.f Model arfaethedig lle mae DARS-AS1 yn rheoleiddio llwybr PACT-PKR a thwf tiwmor.
Er mwyn deall effaith glinigol DARS-AS1 yn well, archwiliwyd y gydberthynas rhwng ei fynegiant a goroesiad claf.Trwy ddadansoddi set ddata TCGA, canfuom fod mynegiant DARS-AS1 uwch yn gysylltiedig â melanoma uveal (UVM), cromoffobia arennol (KICH), carcinoma celloedd papilari arennol (KIRP), mesothelioma (MESO), amlblecs.Roedd cysylltiad arwyddocaol rhwng cyfraddau goroesi is â morffosis glioblastoma (GBM) a chleifion â glioma ymennydd gradd isel (LGG) (Ffigur 5e).Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai DARS-AS1 chwarae rhan bwysig mewn dilyniant tiwmor clinigol ac y gallai fod yn fiomarcwr rhagfynegol posibl mewn canserau lluosog.
Yn yr astudiaeth hon, gan ddefnyddio sgrinio swyddogaethol CRISPRi ar raddfa fawr, fe wnaethom benderfynu bod lncRNA DARS-AS1 yn goresgyn straen celloedd canser trwy reoleiddio dau ymatebydd straen allweddol, PACT a PKR.Trwy ryngweithio'n uniongyrchol â PACT, rhwystrodd DARS-AS1 actifadu PKR wedi'i gyfryngu gan PACT, a thrwy hynny atal marwolaeth celloedd apoptotig a hyrwyddo amlhau celloedd (Ffig. 5f).Gwelwyd dadreoleiddio DARS-AS1 mewn sawl math o ganser, sy'n awgrymu y gallai ei swyddogaeth o hyrwyddo goroesiad celloedd canser o dan amodau straen fod yn berthnasol yn fras i fathau lluosog o ganser.
Mae PACT wedi'i nodi fel protein actifadu PKR, ac mae gweithrediad PKR wedi'i gyfryngu gan PACT yn chwarae rhan bwysig mewn ymatebion straen trwy reoleiddio trawsgrifio, cyfieithu, apoptosis, a phrosesau cellog pwysig eraill62.Ers degawdau, gwnaed ymdrechion i ddeall rheoleiddio canser-benodol y rhaeadru PACT-PKR.Yma, datgelodd ein hastudiaeth fecanwaith gwahanol o reoleiddio PACT-PKR mewn celloedd canser trwy lncRNA cellog DARS-AS1, sy'n clymu'n uniongyrchol â PACT, yn blocio rhyngweithio PACT-PKR, yn atal actifadu PKR a ffosfforyleiddiad eIF2α, a thrwy hynny yn atal apoptosis a achosir gan straen a ysgogi ymlediad canser yn y pen draw.celloedd.Mae'r darganfyddiad hwn yn taflu goleuni ar dargedau lncRNA posibl ar gyfer prognosis a therapi canser.
Dangosodd ein data fod dymchweliad DARS-AS1 yn sensiteiddio celloedd i newyn serwm gyda chynnydd sylweddol mewn PKR ffosfforyleiddiad ac eIF2α.Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod DARS-AS1 yn hyrwyddo goroesiad celloedd canser o dan amodau llym trwy atal gweithgaredd PACT / PKR.Mae nifer o RNAs eraill nad ydynt yn codio, megis ASPACT ac nc886, hefyd yn ymwneud â'r echel PACT/PKR trwy is-reoleiddio mRNA PACT48 neu reoleiddio awtoffosfforyleiddiad trwy rwymo i PKR49,50,64.Yn eu plith, mae DARS-AS1 yn tarfu ar y gymdeithas PACT-PKR.Mae'r astudiaeth hon yn cyfoethogi ein dealltwriaeth o reoleiddio echel PACT/PKR a rôl lncRNAs mewn ymatebion straen.
Mae PACT yn cynnwys tri pharth ar wahân.Mae pob un o'r ddau dsRBD cyntaf yn ddigon i gyflawni rhwymiad affinedd uchel o PACT i PKR, tra bod angen y trydydd parth (D3) ar gyfer actifadu PKR in vitro ac in vivo.Dangosodd ein hastudiaeth fod DARS-AS1 yn rhyngweithio'n ffafriol â'r parth D3 (Ffig. 3h).O ystyried maint mawr yr lncRNA (768 niwcleotidau), gall rhwymo DARS-AS1 i D3 atal yn gorfforol y rhyngweithio rhwng parth PACT dsRBD a PKR, a thrwy hynny rwystro cysylltiad PACT a PKR.Fe wnaeth treigladau pwynt PACT a ddisodlodd Ser246 a Ser287 yn D3 gyda alanine neu aspartate amharu ar ei gysylltiad rhwymo ar gyfer DARS-AS1, gan dynnu sylw at bwysigrwydd priodweddau strwythurol a thrydanol cyffredinol D3 yn eu cysylltiad.Bydd angen rhagor o fanylion am y mecanwaith hwn yn y dyfodol, gan ddefnyddio dadansoddiad biocemegol manylach a dadansoddiad strwythurol PACT cydraniad uchel.
Mae astudiaethau blaenorol wedi nodi bod DARS-AS1 yn hyrwyddo amlhau celloedd trwy sawl mecanwaith51,52,53.Mewn un enghraifft, sylwodd ymchwilwyr fod DARS-AS1 wedi uwchreoleiddio ei genyn DARS sy'n amgodio protein antisense trwy dargedu miP-194-5p mewn celloedd canser yr arennau.Fodd bynnag, yn yr astudiaeth bresennol, ni chafodd dymchweliad DARS-AS1 fawr o effaith ar drawsgrifio DARS mewn sawl math o ganser, gan gynnwys o leiaf canser y colon a'r rhefr, y fron a chanser yr afu.Oherwydd bod lncRNAs yn arddangos patrymau mynegiant cell- a meinwe-benodol, efallai na fydd mecanweithiau swyddogaethol yn cael eu cadw ar draws mathau o ganser, a allai gyfrannu at yr anghysondeb hwn rhwng ein harsylwadau ac asesiadau blaenorol o wahanol ganserau.Mae angen astudiaethau arbennig i egluro mecanweithiau penodol amrywiol brosesau ffisiolegol a phatholegol.
Dangosodd dadansoddiad o ddata clinigol fod cysylltiad gwrthdro rhwng mynegiant DARS-AS1 mewn tiwmorau a goroesiad cleifion canser, sy'n tanlinellu pwysigrwydd echel DARS-AS1 / PACT / PKR mewn prognosis canser.I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos bod DARS-AS1 yn rheolydd echel signalau PACT/PKR, yn hyrwyddo amlhau celloedd canser, ac yn atal apoptosis yn ystod yr ymateb straen, sy'n darparu llinell arall o ymchwil ac sydd o ddiddordeb ar gyfer ymchwil yn y dyfodol i driniaethau posibl .
Cafwyd llinellau celloedd dynol SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 a HEK293T o'r Seilwaith Adnoddau Llinell Cell Cenedlaethol yn Tsieina.Cynhaliwyd yr holl gelloedd mewn cyfrwng DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) wedi'i ategu â 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) a 1% penisilin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ar 37 ° C, 5% CO2.deorydd.
Gwrth-PACT, Abcam (ab31967);Gwrth-PKR, Abcam (ab184257);Gwrth-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Gwrth-Flag, Abcam (ab125243);Gwrth-eIF2α, Abcam (A0764) );gwrth-eIF2α (ffosfforws S51), Abcam (ab32157);gwrth-PACT (ffosfforws S246), Abgent (AP7744b);gwrth-β-tiwbwlin, CST (2128);llygoden arferol IgG, CST (5415S);IgG cwningen arferol, CST (2729S).Cafodd gwrthgyrff eu gwanhau 1:1000 yn PBST ar gyfer blotio Gorllewinol ac 1:100 ar gyfer IP.
datblygwyd sgRNAs gan ddefnyddio offeryn sydd ar gael yn gyhoeddus o'r enw CRISPR-ERA66.Defnyddiwyd y paramedrau offer rhagosodedig ar gyfer datblygu sgRNA a safleoedd rhwymo sgRNA a gyfrifwyd gan yr algorithm yn y rhanbarth 3 kb.wedi'i ganoli ar TSS.Cafodd pyllau o oligonucleotidau sgRNA eu syntheseiddio yn CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) a'u clonio i mewn i blasidau pgRNA dynoledig (Addgene #44248).Cafodd cyfanswm o 12 µg o plasmid pgRNA dynoledig cyfun, 7.2 µg o psPAX2 (Addgene #12260), a 4.8 µg o pMD2.G (Addgene #12259) eu cyd-drawsgludo i 5 x 106 HEK293T gan ddefnyddio DNA Transfection Transfection in 1fecta cm. celloedd (CWBIO, Beijing, Tsieina) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.Casglwyd supernatants sy'n cynnwys firws 48 a 72 awr ar ôl eu trawsgludo a'u hidlo trwy ffilter 0.45 µm.Ar gyfer sgrinio, cafwyd celloedd SW620 sy'n mynegi'r protein ymasiad dCas9/KRAB trwy drawsgludiad firws.Cafodd celloedd SW620 wedi'u haddasu eu heintio â'r llyfrgell firws mewn pedwar arbrawf haint annibynnol mewn MOI o 0.1-0.3 a chawsant eu samplu â 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) am 2 ddiwrnod.Wedi hynny, cafodd celloedd eu meithrin am 18 diwrnod in vitro gydag isafswm cwmpas llyfrgell o 500 o gelloedd/sgRNA ar gyfer sgrinio.
Echdynnwyd DNA genomig yn unol â chyfarwyddiadau Pecyn Midi Gwaed DNA QIAamp (QIAGEN, Düsseldorf, yr Almaen; 51183).Defnyddiwyd cyfanswm o 100 μg o DNA genomig fesul ailadrodd biolegol i adeiladu'r llyfrgell.Cafodd rhanbarth sgRNA ei chwyddo gan ddwy rownd o PCR a'i gysylltu â chod bar.
Cafodd cynhyrchion PCR eu puro gan ddefnyddio gel NucleoSpin® a phecyn puro PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, yr Almaen; 740609.250) a'u mesur gan ddefnyddio pecyn canfod DNA llinyn dwbl Qubit ™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Defnyddiwyd assay MTS i fesur amlhau celloedd.Cafodd celloedd eu hadu mewn platiau 96-ffynnon ar ddwysedd cychwynnol o 2000 o gelloedd/ffynnon.Mesurwyd nifer cymharol y celloedd yn ddyddiol ar yr amser a nodwyd am gyfanswm o 4-6 diwrnod.Ar gyfer pob ffynnon, gwanhawyd 20 μl o adweithydd MTS (Promega) â 100 μl o DMEM, wedi'i ddeor â chelloedd am 4 h ar 37 ° C, ac yna mesurwyd OD490.
Darganfuwyd y gallu ar gyfer twf heb ei angori trwy ddadansoddi ffurfiant sfferau.Yn gryno, cafodd 2000 o gelloedd a drawslifwyd â shRNA DARS-AS1 neu shRNA rheoli eu meithrin mewn microplates atodiad isel iawn (Corning) gyda newid canolig bob 4 diwrnod.Cafodd y sfferoidau eu cyfrif ar ôl 14 diwrnod.Defnyddiwyd 500 o gelloedd a drosglwyddwyd â gorfynegiant DARS-AS1 neu plasmid rheoli ar gyfer yr assay gwella, fel arall nid oedd y dull wedi newid.
Trawsgrifiwyd RNA gan ddefnyddio T7 RNA polymerase a biotin-16-UTP (Roche 1138908910) yn unol â chyfarwyddiadau Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Rhestrir y paent preimio a ddefnyddir yma yn Nhabl Atodol 4.
Cafodd rhanbarthau PACT neu PKR codio protein eu clonio i mewn i pET15b (Addgene #73619) a'u trawsnewid yn BL21(DE3).Deorwyd y bacteria dros nos mewn LB wedi'i gyflenwi ag ampicillin ac yna'n cael ei wanhau 100 gwaith gyda LB ffres.Pan gyrhaeddodd OD600 y cyfrwng 0.8, ychwanegwyd 1 mM IPTG i gymell mynegiant protein.Ar ôl deori dros nos gydag ysgwyd ysgafn (250 rpm ar 20 ° C), casglwyd y belen gell trwy allgyrchiad (4000 rpm, 10 munud, 4 ° C).Ail-ddaliwch y belen gell mewn byffer lysis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, PMSF 1 mM) a deorwch ar rew am 30 munud, yna sonigad (15 munud, 5 s ymlaen / i ffwrdd, ar rew) a centrifuge (13,000 rpm)., 30 mun, 4°С).Yna llwythwyd y supernatant ar resin Ni-NTA (QIAGEN) 3 gwaith ar 4°C, ei olchi 4 gwaith gyda byffer golchi (50 mM Tris, pH 8.0, imidazole 40 mM, 250 mM NaCl) a'i eliwio 3 gwaith, gyda chyfanswm o byffer eluent 10 ml (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, imidazole 300 mM).Penderfynwyd ar brotein wedi'i buro gan ddefnyddio WB a phennwyd y crynodiad gan ddefnyddio pecyn assay protein Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Cynhaliwyd profion RIP fel y disgrifiwyd yn flaenorol, gydag addasiadau.Yn gryno, mae byffer RIP 1x (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, atalydd ribonuclease RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatig 1 x 107 coctel (Roche, 1 mM DTT) a centrifuge ar 13,000 rpm am 15 munud ar 4 ° C.Yna deorwyd yr uwchnatant â gleiniau magnetig protein A+G (Millipore) wedi'u cyfuno â 5 μg o wrthgorff gwrth-PACT (Abeam) neu IgG (CST).Cafodd y gleiniau eu golchi 5 gwaith gyda byffer RIP 5x, yna eu treulio â proteinase K (NEB).Echdynnwyd RNA gyda Trizol a'i bennu gan RT-qPCR.Cyflwynir preimwyr yn Nhabl Atodol 5.
Perfformiwyd yr assay RIP in vitro yn unol â phrotocol assay RIP safonol wedi'i addasu.Cafodd cyfanswm o 5 pmol o RNA trawsgrifiedig in vitro ei wanhau 1x gyda byffer RIP a'i anelio gan ddeor ar 65 ° C am 5 munud ac yna oeri araf i dymheredd ystafell.Cafodd cyfanswm o 5 pmol o broteinau PACT cyfan neu wedi'u treiglo â label baner eu puro o E. coli.Deorwch ag RNA wedi'i ail-natureiddio am 2 awr ar 4°C a dilynwch y weithdrefn uchod ar gyfer dadansoddi RIP ar gyfer IP gwrth-faner.
Ar gyfer dadansoddiad estyniad RNA, cafodd celloedd 1 × 107 eu gorchuddio â byffer 1xRIP.Ar ôl centrifugio ar 13,000 rpm am 15 munud ar 4 ° C, cafodd y supernatant ei drin ymlaen llaw gyda 30 μl o gleiniau magnetig streptavidin (Beckman) am 2 awr ar 4 ° C.Yna rhoddwyd tRNA burum i'r lysad wedi'i buro a'i ddeor â 40 pmol o RNA wedi'i ail-natureiddio dros nos ar 4°C, yna am 2 awr arall ac ychwanegwyd 20 μl o fwclis magnetig streptavidin newydd wedi'u blocio â BSA.Roedd y cam golchi yn cynnwys 4 gwaith gyda byffer RIP 5x a 4 gwaith gyda byffer RIP 1x.Cafodd y proteinau cyfatebol eu hanwybyddu â byffer elution biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) a'u gwahanu ar NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Ar ôl staenio arian (Beyotime Biotechnology), cafodd rhai bandiau eu tynnu allan a'u dadansoddi gan MS.
Perfformiwyd dadansoddiad Cyd-IP i brofi'r rhyngweithio rhwng PACT a PKR.Yn gryno, paratowyd lysadau supernatant trwy ddeor 1 x 107 o gelloedd lysed mewn byffer 1 x RIP ac yna centrifugation ar 13,000 rpm am 15 munud ar 4°C.Llwythwyd lysates â gleiniau magnetig protein A + G, wedi'u cyfosod â 5 µg o wrthgorff gwrth-PACT, a'u cylchdroi'n ysgafn dros nos ar 4 ° C.Golchwyd y gleiniau 3 gwaith gyda byffer 5 × RIP, ddwywaith gyda byffer 1 × RIP a'u hegluro â byffer 1 × SDS.Dadansoddwyd y protein a adferwyd gan gel SDS-PAGE a'i ganfod gan WB.
Cafodd dau pmol o PACT â fflag ac 1 pmol o PKR eu puro rhag E. coli.Gwanhau mewn byffer RIP 1 × a deor gyda 10 pmol o RNA ail-natureiddio am 2 awr ar 4 ° C.Ar ôl hynny, cawsant eu deor â gwrthgorff gwrth-labelu wedi'i gyd-labelu â gleiniau magnetig protein A+G am ddwy awr ychwanegol.Yna cafodd y gleiniau eu golchi bedair gwaith gyda byffer RIP 1x a'u cuddio â byffer SDS 1x.Canfuwyd y PACT a'r PKR dilynol gan WB.
Amser post: Medi-23-2022
