Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Defnyddir dulliau labelu agosrwydd ensymatig sy'n seiliedig ar esterau actifedig neu radicalau ffenoxy yn eang i fapio proteomau isgellog a rhyngweithyddion protein mewn celloedd byw.Fodd bynnag, mae esterau actifedig yn llai adweithiol, gan arwain at radiws labelu eang, a gall radicalau ffenoxy a gynhyrchir gan driniaeth perocsid ymyrryd â llwybrau rhydocs.Yma rydym yn adrodd ar ddull ffotoactivation sy'n dibynnu ar labelu agosrwydd (PDPL) a ddatblygwyd trwy gysylltu'r protein ffotosensitizer miniSOG yn enetig â phrotein o ddiddordeb.Wedi'i ysgogi gan olau glas a'i reoli gan amser datguddio, cynhyrchir ocsigen singlet ac yna cyflawnir labelu gweddillion histidine wedi'i ddatrys yn ysbeidiol gan yr archwiliwr anilin.Rydym yn dangos ei ffyddlondeb uchel trwy fapio proteome organelle-benodol.Mae cymhariaeth ochr yn ochr o PDPL â TurboID yn dangos sylw proteomig mwy penodol a chynhwysfawr o PDPL.Nesaf, gwnaethom gymhwyso PDPL i'r cydweithredwr trawsgrifio BRD4 ac E3 Parkin ligase sy'n gysylltiedig â chlefyd a chanfod rhyngweithyddion anhysbys o'r blaen.Trwy sgrinio gorfynegiant, nodwyd dwy swbstrad anhysbys, Ssu72 a SNW1, ar gyfer Parkin, y mae eu diraddiad yn cael ei gyfryngu gan y llwybr hollbresennol-proteasom.
Mae nodweddu rhwydweithiau protein yn gywir yn sail i lawer o brosesau cellog sylfaenol.Felly, bydd mapio amserol iawn o ryngweithiadau protein yn darparu sail foleciwlaidd ar gyfer dehongli llwybrau biolegol, patholeg afiechyd, ac amharu ar y rhyngweithiadau hyn at ddibenion therapiwtig.I'r perwyl hwn, mae dulliau sy'n gallu canfod rhyngweithiadau tymhorol mewn celloedd byw neu feinweoedd yn ddymunol iawn.Yn hanesyddol, defnyddiwyd Sbectrometreg Màs Puro Affinedd (AP-MS) i nodi partneriaid rhwymol proteinau o ddiddordeb (POI).Gyda datblygiad dulliau proteomeg meintiol, crëwyd Bioplex3.0, y gronfa ddata fwyaf o rwydweithiau protein yn seiliedig ar AP-MS.Er bod AP-MS yn bwerus iawn, mae'r camau lysis celloedd a gwanhau yn y llif gwaith yn gogwyddo tuag at ryngweithiadau rhwymo gwan a dros dro ac yn cyflwyno arteffactau ôl-lysis fel parau rhyngweithio ffug nad oes ganddynt adrannu cyn lysis.
Er mwyn mynd i'r afael â'r materion hyn, mae asidau amino annaturiol (UAA) gyda grwpiau croesgysylltu a llwyfannau labelu ensymatig cyfagos (PL) (ee APEX a BioID)5 wedi'u datblygu.Er bod y dull UAA wedi'i gymhwyso'n llwyddiannus mewn llawer o senarios ac yn darparu gwybodaeth am gludyddion protein uniongyrchol, mae angen optimeiddio safle mewnosod UAA o hyd.Yn bwysicach fyth, mae'n ddull labelu stoichiometrig nad oes ganddo wrthdroad catalytig o ddigwyddiadau labelu.Mewn cyferbyniad, mae dulliau PL ensymatig, megis y dull BioID, yn asio'r ligas biotin wedi'i beiriannu i POI7, sydd wedyn yn actifadu biotin i ffurfio canolradd ester biotinyl-AMP adweithiol.Felly mae'r ensym yn cataleiddio ac yn rhyddhau “cwmwl” biotin actifedig sy'n labelu gweddillion lysin procsimol.Fodd bynnag, mae angen mwy na 12 awr ar BioID i gael signal wedi'i labelu'n ddigonol, sy'n atal ei ddefnyddio gyda chydraniad amser.Gan ddefnyddio esblygiad cyfeiriedig yn seiliedig ar arddangosiad burum, cynlluniwyd TurboID yn seiliedig ar BioID i fod yn fwy effeithlon, gan ganiatáu labelu effeithlon gyda biotin o fewn 10 munud, gan ganiatáu i brosesau mwy deinamig gael eu hastudio.Oherwydd bod TurboID yn weithgar iawn a bod lefelau biotin mewndarddol yn ddigonol ar gyfer labelu lefel isel, mae labelu cefndir yn dod yn broblem bosibl pan fydd angen labelu uwch ac amseredig iawn trwy ychwanegu biotin alldarddol.Yn ogystal, mae esters actifedig yn adweithiol yn wael (t1/2 ~ 5 min), a all arwain at radiws labelu mawr, yn enwedig ar ôl dirlawnder proteinau cyfagos â biotin 5. Mewn dull arall, mae cyfuniad genetig o ascorbate peroxidase wedi'i beiriannu (hy biotin- radicalau ffenol ac yn caniatáu labelu protein o fewn un munud9,10.Defnyddir APEX yn eang i nodi proteomau isgellog, cyfadeiladau protein bilen, a chymhlygion protein signalau cytosolig11,12.Fodd bynnag, gall yr angen am grynodiadau uchel o berocsidau effeithio ar broteinau rhydocs neu lwybrau, gan amharu ar prosesau cellog.
Felly, bydd dull newydd sy'n gallu cynhyrchu mwy o rywogaethau atal radiws â label adweithiol gyda chywirdeb gofodol ac amser uchel heb amharu'n sylweddol ar lwybrau cellog yn ychwanegiad pwysig at ddulliau presennol. Ymhlith y rhywogaethau adweithiol, fe wnaeth ocsigen singlet ennyn ein sylw oherwydd ei oes fer a'i radiws tryledu cyfyngedig (t1/2 < 0.6 µs mewn celloedd)13. Ymhlith y rhywogaethau adweithiol, fe wnaeth ocsigen singlet ennyn ein sylw oherwydd ei oes fer a'i radiws tryledu cyfyngedig (t1/2 < 0.6 µs mewn celloedd)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Ymhlith y ffurfiau gweithredol, denodd ocsigen singlet ein sylw oherwydd ei oes fer a'i radiws tryledu cyfyngedig (t1/2 < 0.6 µs mewn celloedd)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µ漕漉 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Ymhlith ffurfiau gweithredol, mae ocsigen singlet yn denu ein sylw oherwydd ei oes fer a'i radiws trylediad cyfyngedig (t1/2 <0.6 μs mewn celloedd).Adroddwyd bod ocsigen Singlet yn ocsideiddio methionin, tyrosin, histidine a thryptoffan ar hap, gan ei wneud yn begynol 14,15 i'w gysylltu â chwiliedyddion amin neu thiol16,17.Er bod ocsigen singlet wedi'i ddefnyddio i labelu RNA adran isgellog, mae strategaethau ar gyfer ail-bwrpasu marcwyr agosrwydd POI mewndarddol heb eu harchwilio o hyd.Yma, rydyn ni'n cyflwyno platfform o'r enw labelu agosrwydd sy'n dibynnu ar ffotoactivation (PDPL), lle rydyn ni'n defnyddio golau glas i oleuo POIs wedi'i asio â ffotosensitydd miniSOG a sbarduno cynhyrchu ocsigen singlet i ocsideiddio gweddillion procsimol, ac yna addasiadau sy'n cynnwys amin i ocsideiddio stilwyr cemegol i mewn. celloedd byw canolradd..Fe wnaethon ni brofi grŵp o stilwyr cemegol i wneud y mwyaf o benodolrwydd tagiau a nodwyd safleoedd addasu gan ddefnyddio llif gwaith proteomeg agored.Mae cymhariaeth ochr yn ochr o PDPL â TurboID yn dangos sylw proteomig mwy penodol a chynhwysfawr o PDPL.Cymhwyswyd y dull hwn i farcwyr organelle-benodol o'r proteome isgellog ac adnabod proteome cyffredinol o bartneriaid rhwymol ar gyfer y protein rheoleiddio epigenetig sy'n gysylltiedig â chanser BRD4 a Parkin ligas E3 sy'n gysylltiedig â chlefyd Parkinson, a gadarnhaodd rwydwaith hysbys ac anhysbys o brotein. rhyngweithiadau..Mae gallu PDPL i adnabod swbstradau E3 mewn cyfadeiladau protein mawr yn cynrychioli sefyllfa lle mae angen adnabod rhwymwyr anuniongyrchol.Mae dau swbstrad parkin anhysbys wedi'u cyfryngu gan ubiquitination-proteasome wedi'u cadarnhau yn y fan a'r lle.
Therapi ffotodeinamig (PDT)19 ac anactifadu laser â chymorth cromoffor (CALI)20, lle mae arbelydru golau gyda ffotosensiteiddwyr yn cynhyrchu ocsigen sengl, yn gallu anactifadu proteinau targed neu achosi marwolaeth celloedd.Gan fod ocsigen singlet yn sylwedd adweithiol iawn gyda phellter trylediad damcaniaethol o tua 70 nm, gellir rheoli ocsidiad cyfyngedig yn ofodol o amgylch y ffotosensitizer.Yn seiliedig ar y cysyniad hwn, penderfynasom ddefnyddio ocsigen singlet i gyflawni labelu agos o gyfadeiladau protein mewn celloedd byw.Rydym wedi datblygu dull cemoproteomig PDPL i gyflawni pedair swyddogaeth: (1) i gataleiddio cynhyrchu ocsigen sengl gweithredol tebyg i ddull enzymatig PL;(2) darparu labeli wedi'u datrys gan amser ar gychwyn golau;(3) trwy newid (4) Osgoi defnyddio cofactors mewndarddol (fel biotin) i leihau cefndir, neu ddefnyddio adweithyddion alldarddol sy'n tarfu'n fawr (fel perocsidau) i leihau amlygiad celloedd i straen amgylcheddol.
Gellir rhannu ffotosensitizers yn ddau gategori gan gynnwys fflworofforau pwysau moleciwlaidd bach (ee bengal rhosyn, glas methylene)22 a phroteinau bach wedi'u hamgodio'n enetig (ee miniSOG, KillerRed)23.Er mwyn cyflawni dyluniad modiwlaidd, fe wnaethom ddatblygu platfform PDPL cenhedlaeth gyntaf trwy ychwanegu proteinau ffotosensitizer (PS) i POI24,25 (Ffigur 1a).Pan gaiff ei arbelydru â golau glas, mae ocsigen singlet yn ocsideiddio gweddillion asid amino niwclioffilig procsimol, gan arwain at bolaredd umpolung sy'n electroffilig ac sy'n gallu adweithio ymhellach â niwcleoffilau chwiliwr amin16,17.Mae'r stiliwr wedi'i gynllunio gyda handlen alcyn i ganiatáu clicio cemeg a thynnu i lawr ar gyfer nodweddu LC/MS/MS.
Darlun sgematig o labelu cymhlygion protein wedi'u cyfryngu gan miniSOG.Pan fyddant yn agored i olau glas, mae celloedd sy'n mynegi miniSOG-POI yn cynhyrchu ocsigen singlet, sy'n addasu proteinau rhyngweithiol ond nid proteinau nad ydynt yn rhwymol.Mae cynhyrchion ffotoocsidiad canolradd yn cael eu rhyng-gipio gan labeli cyfnewid y chwiliwr cemegol amin i ffurfio adwythion cofalent.Mae'r grŵp alcynyl ar y chwiliedydd cemeg yn caniatáu cemeg clic ar gyfer cyfoethogi trwy dynnu i lawr ac yna meintioli LC-MS/MS.b Adeiledd cemegol stilwyr amin 1-4.c Dadansoddiad gel fflwroleuol cynrychioliadol o farcwyr proteomig miniSOG-gyfryngol lleoledig mitocondriaidd gan ddefnyddio chwilwyr 1-4 a meintioliad cymharol yn seiliedig ar densitometreg gel.Aseswyd y gymhareb signal-i-gefndir o stilwyr cemegol gan ddefnyddio arbrofion rheoli negyddol heb gynnwys golau glas neu ddefnyddio celloedd HEK293T heb fynegiant miniSOG.n = 2 sampl fiolegol annibynnol.Mae pob dot yn cynrychioli replica biolegol.d Canfod a meintioli PDPL yn gynrychioliadol gan ddefnyddio chwiliwr 3 wedi'i optimeiddio ym mhresenoldeb neu absenoldeb y cydrannau PDPL a nodir fel c.n = 3 sampl fiolegol annibynnol.Mae pob dot yn cynrychioli replica biolegol.Mae llinellau canol a wisgers yn cynrychioli'r gwyriad cymedrig a ± gwyriad safonol.CBB: Coomassie Brilliant Blue.d Delweddu cydffocal o ocsigen singlet gyda staen Si-DMA coch pell.Bar graddfa: 10 µm.Cafodd delweddu gel ac arbrofion confocal eu hailadrodd yn annibynnol o leiaf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.
Fe wnaethom brofi yn gyntaf allu'r ffotosensitizers aeddfed miniSOG26 a KillerRed23, a fynegir yn sefydlog yn HEK293T, i gyfryngu labelu propargylamine o'r proteome fel chwiliedydd cemegol (Ffig Atodol 1a).Dangosodd dadansoddiad fflworoleuedd gel fod labelu proteome cyfan wedi'i gyflawni gan ddefnyddio miniSOG ac arbelydru golau glas, tra na welwyd unrhyw gynnyrch labelu gweladwy gyda KillerRed.Er mwyn gwella'r gymhareb signal-i-gefndir, fe wnaethon ni wedyn brofi set o stilwyr cemegol yn cynnwys anilin (1 a 3), propylamine (2), neu benzylamin (4).Gwelsom fod gan gelloedd HEK293T eu hunain signal cefndir uwch o gymharu â dim golau glas, o bosibl oherwydd y ffotosensiteiddiwr ribofflafin mewndarddol, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Roedd stilwyr cemegol 1 a 3 yn seiliedig ar anilin yn rhoi gwell penodoldeb, gyda HEK293T yn mynegi miniSOG yn sefydlog mewn mitocondria yn arddangos cynnydd >8-plyg yn y signal ar gyfer chwiliedydd 3, tra bod chwiliedydd 2 yn defnyddio yn y dull labelu RNA CAP-seq yn arddangos ~2.5- yn unig cynnydd signal plyg, yn debygol o ganlyniad i ddewisiadau adweithedd gwahanol rhwng RNA a phrotein (Ffig. 1b, c). Roedd stilwyr cemegol 1 a 3 yn seiliedig ar anilin yn rhoi gwell penodoldeb, gyda HEK293T yn mynegi miniSOG yn sefydlog mewn mitocondria yn arddangos cynnydd >8-plyg yn y signal ar gyfer chwiliedydd 3, tra bod chwiliedydd 2 yn defnyddio yn y dull labelu RNA CAP-seq yn arddangos ~2.5- yn unig cynnydd signal plyg, yn debygol o ganlyniad i ddewisiadau adweithedd gwahanol rhwng RNA a phrotein (Ffig. 1b, c).Roedd stilwyr cemegol 1 a 3 yn seiliedig ar anilin yn dangos gwell penodoldeb: mae HEK293T, sy'n mynegi miniSOG yn sefydlog mewn mitocondria, yn dangos mwy na chynnydd 8-plyg yn y signal ar gyfer stiliwr 3, tra bod stiliwr 2, a ddefnyddir yn y dull labelu RNA CAP-seq, yn unig yn dangos ~2.5-plyg cynnydd signal, yn ôl pob tebyg oherwydd dewisiadau adweithedd gwahanol rhwng RNA a phrotein (Ffig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 增加 ， ， 而 用 于 于 于 于 于 标记 标记 方法 方法 方法 cap-seq 的 的 仅 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 方法 方法2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， ， ， 在 在 粒体 中 中 表达 表达 minisog ， 探针 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 增加 而 而 于 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNARoedd gan chwiliedyddion cemegol anilin 1 a 3 well penodoldeb, mynegodd HEK293T miniSOG yn sefydlog mewn mitocondria, ac roedd gan chwiliedydd 3 gynnydd dros 8 gwaith yn fwy yn y signal, tra dangosodd stiliwr 2 ar gyfer dull labelu RNA CAP-seq dim ond ~2.5 -plyg o gynnydd.yn y signal, yn ôl pob tebyg oherwydd gwahanol ddewisiadau adwaith rhwng RNA a phrotein (Ffig. 1b, c).Yn ogystal, prob isomerau 3 a stiliwr hydrasin (stilwyr 5, 6, 7), gan gadarnhau optimeiddio stiliwr 3 (Ffig Atodol 1b,c).Yn yr un modd, datgelodd dadansoddiad fflworoleuedd mewn-gel baramedrau arbrofol eraill wedi'u optimeiddio: tonfedd arbelydru (460 nm), crynodiad stiliwr cemegol (1 mM), ac amser arbelydru (20 mun) (Ffig Atodol 2a-c).Arweiniodd hepgor unrhyw gydran neu gam yn y protocol PDPL at wrthdroi signal sylweddol i'r cefndir (Ffig. 1d).Yn nodedig, gostyngwyd labelu protein yn sylweddol ym mhresenoldeb sodiwm azide neu trolox, y gwyddys eu bod yn diffodd ocsigen singlet.Mae presenoldeb D2O, y gwyddys ei fod yn sefydlogi ocsigen singlet, yn gwella'r signal labelu.Er mwyn ymchwilio i gyfraniad rhywogaethau ocsigen adweithiol eraill i labelu, ychwanegwyd manitol a fitamin C i sefydlu sborionwyr radical hydroxyl a superoxide, yn y drefn honno, 18, 29, ond ni chanfuwyd eu bod yn lleihau labelu.Ni arweiniodd ychwanegu H2O2, ond nid goleuo, at labelu (Ffig Atodol 3a).Cadarnhaodd delweddu ocsigen singlet fflworoleuedd gyda stilwyr Si-DMA bresenoldeb ocsigen singlet yn y wifren HEK293T-miniSOG, ond nid yn y wifren HEK293T wreiddiol.Yn ogystal, ni allai mitoSOX Red ganfod cynhyrchiad superoxide ar ôl goleuo (Ffig. 1e a Ffig. Atodol 3b) 30. Mae'r data hyn yn awgrymu'n gryf mai ocsigen singlet yw'r prif rywogaethau ocsigen adweithiol sy'n gyfrifol am labelu proteomig dilynol.Aseswyd sytowenwyndra PDPL gan gynnwys arbelydru golau glas a chwilwyr cemegol, ac ni welwyd unrhyw sytowenwyndra arwyddocaol (Ffig Atodol 4a).
Er mwyn astudio'r mecanwaith labelu a galluogi adnabod proteomig o gyfadeiladau protein gan ddefnyddio LC-MS/MS, yn gyntaf mae angen i ni benderfynu pa asidau amino sy'n cael eu haddasu a màs delta labeli stiliwr.Adroddwyd bod methionin, histidine, tryptoffan a thyrosin wedi'u haddasu gan ocsigen sengl14,15.Rydym yn integreiddio llif gwaith TOP-ABPP31 gyda'r chwiliad agored diduedd a ddarperir gan lwyfan cyfrifiadurol FragPipe yn seiliedig ar MSFragger32.Ar ôl addasu ocsigen singlet a labelu chwiliwr cemegol, perfformiwyd cemeg clicio gan ddefnyddio label lleihau biotin yn cynnwys cysylltydd holltadwy, ac yna ymestyn neutravidin a threuliad trypsin.Cafodd y peptid wedi'i addasu, sy'n dal i fod wedi'i rwymo i'r resin, ei ffoto-glocio ar gyfer dadansoddiad LC-MS/MS (Ffigur 2a a Data Atodol 1).Digwyddodd nifer fawr o addasiadau ledled y proteome gyda thros 50 o barau map peptid (PSM) wedi'u rhestru (Ffig. 2b).Yn syndod, dim ond newid histidine a welsom, mae'n debyg oherwydd adweithedd uwch histidin ocsidiedig tuag at chwilwyr anilin nag asidau amino eraill.Yn ôl y mecanwaith cyhoeddedig o ocsidiad histidine gan ocsigen singlet,21,33 mae'r strwythur delta-màs arfaethedig o +229 Da yn cyfateb i adwythiad chwiliwr 3 gyda 2-ocso-histidine ar ôl dau ocsidiad, a +247 Da yw'r cynnyrch hydrolysis o +229 Da (Ffig Atodol 5).Dangosodd gwerthusiad o'r sbectrwm MS2 ddibynadwyedd uchel o ran adnabod y rhan fwyaf o'r ïonau y a b, gan gynnwys adnabod ïonau darn wedi'u haddasu (y a b) (Ffig. 2c).Datgelodd dadansoddiad cyd-destun o'r dilyniant lleol o histidinau a addaswyd gan PDPL fod motiff cymedrol yn ffafrio gweddillion hydroffobig bach ar safleoedd ±1 (Ffig Atodol 4b).Ar gyfartaledd, nodwyd 1.4 histidin fesul protein, a phennwyd safleoedd y marcwyr hyn gan arwynebedd arwyneb hygyrch toddyddion (SASA) a dadansoddiad argaeledd toddyddion cymharol (RSA) (Ffig Atodol 4c,d).
Llif gwaith diduedd ar gyfer astudio detholedd gweddilliol gan ddefnyddio platfform cyfrifiadurol FragPipe sy'n cael ei bweru gan MSFragger.Defnyddir cysylltwyr cleavable mewn cemeg Cliciwch i ganiatáu ffoto-hollti o peptidau wedi'u haddasu o resin streptavidin.Lansiwyd chwiliad agored i nodi nifer o addasiadau, yn ogystal â gweddillion perthnasol.b Neilltuo màs yr addasiadau sy'n digwydd ledled y proteome.PSM mapio peptid.c MS2 anodi sbectrol o safleoedd histidine wedi'i addasu gyda stiliwr 3. Fel enghraifft gynrychioliadol, mae adwaith cofalent gyda stiliwr 3 yn ychwanegu +229.0938 Da at yr asid amino wedi'i addasu.d Assay treiglo a ddefnyddir i brofi am farcwyr PDPL.Trawsnewidiwyd PRDX3 (H155A, H225A) a PRDX1 (H10A, H81A, H169A) â phlasmidau math gwyllt ar gyfer canfod gwrth-Faner.e Adweithiwyd y peptid synthetig â miniSOG wedi'i buro ym mhresenoldeb chwiliedydd 3 a nodwyd y cynhyrchion cyfatebol â Δm +247 a +229 yn y sbectrwm LC-MS.f Rhyngweithiadau protein-i-brotein in vitro wedi'u modelu â thag miniSOG-6xHis a gwrthgorff gwrth-6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) a gwrth-lygoden dadansoddiad blot Gorllewinol o gyfadeiladau gwrthgyrff miniSOG-6xHis/anti-6xHis wedi'u labelu â stiliwr 3, yn dibynnu ar yr amser y maent yn dod i gysylltiad â golau.Mynegir labeli ar gyfer proteinau unigol yn y pwysau moleciwlaidd cyfatebol: cadwyn golau gwrthgyrff LC, cadwyn trwm gwrthgorff HC.Ailadroddwyd yr arbrofion hyn yn annibynnol o leiaf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.
Ar gyfer dilysu biocemegol y safle labelu, newidiwyd PRDX3 a PRDX1 a nodwyd gan sbectrometreg màs o histidine i alanin a'u cymharu â math gwyllt mewn profion trawsgludiad.Dangosodd canlyniadau PDPL fod y treiglad yn lleihau labelu yn sylweddol (Ffig. 2d).Yn y cyfamser, cafodd y dilyniannau peptid a nodwyd yn y chwiliad agored eu syntheseiddio a'u adweithio in vitro â miniSOG wedi'i buro ym mhresenoldeb stiliwr 3 a golau glas, gan gynhyrchu cynhyrchion gyda symudiad màs o +247 a +229 Da pan gânt eu canfod gan LC-MS (Ffig. . 2e).).Er mwyn profi a ellid labelu proteinau procsimol rhyngweithiol mewn vitro mewn ymateb i ffotoysgogiad miniSOG, gwnaethom ddylunio assay agosrwydd artiffisial trwy ryngweithio rhwng y protein miniSOG-6xHis a gwrthgorff monoclonaidd gwrth-His in vitro (Ffigur 2f).Yn yr assay hwn, roeddem yn disgwyl labelu procsimol o gadwyni gwrthgyrff trwm ac ysgafn gyda miniSOG.Mewn gwirionedd, roedd gwrth-lygoden (gan gydnabod cadwyni trwm ac ysgafn gwrthgorff gwrth-6xHis-labelu) a streptavidin blots Western yn dangos biotinylation cryf o'r cadwyni trwm ac ysgafn.Yn nodedig, fe wnaethom sylwi ar awtobiotinylation miniSOG oherwydd y tag 6xHis a chroesgysylltiadau rhwng cadwyni ysgafn a thrwm, a allai fod yn gysylltiedig â'r bwlch a ddisgrifiwyd yn flaenorol rhwng ymateb procsimol lysin ac 2-oxo-histidine.I gloi, deuwn i'r casgliad bod PDPL yn addasu histidine mewn modd sy'n dibynnu ar agosrwydd.
Ein nod nesaf oedd nodweddu'r proteome isgellog i brofi penodoldeb labelu in situ.Felly, rydym yn mynegi stably miniSOG yn y cnewyllyn, matrics mitocondriaidd, neu bilen ER allanol o gelloedd HEK293T (Ffig. 3a).Datgelodd dadansoddiad fflworoleuedd gel ddigonedd o fandiau wedi'u labelu mewn tri lleoliad isgellog yn ogystal â phatrymau labelu gwahanol (Ffig. 3b).Dangosodd dadansoddiad delweddu fflworoleuedd hynodrwydd uchel o PDPL (Ffig. 3c).Dilynwyd llif gwaith PDPL gan adweithiau clic gyda llifynnau rhodamine i amlinellu proteomau isgellog gan ddefnyddio microsgopeg fflworoleuedd, a chafodd signalau PDPL eu cydleoli â DAPI, tracwyr mitocondriaidd, neu dracwyr ER, gan gadarnhau ffyddlondeb uchel PDPL.Ar gyfer y tri lleoliad organelle, dangosodd cymhariaeth ochr-yn-ochr o PDPL â TurboID gan ddefnyddio avidin western blot fod PDPL wedi'i labelu'n fwy penodol o'i gymharu â'u rheolaethau priodol.O dan amodau PDPL, ymddangosodd mwy o fandiau wedi'u labelu, gan nodi mwy o broteinau wedi'u labelu â PDPL (Ffig Atodol 6a-d).
Cynrychiolaeth sgematig o labelu proteome organelle-benodol miniSOG.Mae miniSOG yn targedu'r matrics mitocondriaidd trwy ymasiad i'r N-terminal 23 asidau amino o COX4 dynol (mito-miniSOG), y niwclews trwy ymasiad i H2B (cnewyllyn-miniSOG), a Sec61β trwy ochr cytoplasmig y bilen ER (ER-miniSOG). ).Mae'r arwyddion yn cynnwys delweddu gel, delweddu confocal, a sbectrometreg màs.b Delweddau gel cynrychioliadol o dri phroffil PDPL penodol i organynnau.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Delweddau cydffocal cynrychioliadol o gelloedd HEK293T yn mynegi miniSOG yn sefydlog gyda gwahanol leoliadau isgellog wedi'u canfod gan wrthgyrff â label V5 (coch).Defnyddir marcwyr isgellog ar gyfer mitocondria ac ER (gwyrdd).Mae llif gwaith PDPL yn cynnwys canfod proteomau isgellog miniSOG (melyn) wedi'u labelu gan ddefnyddio cemeg clic Cy3-azide.Bar graddfa: 10 µm.d Plotiau folcanig o broteomau wedi'u tagio PDPL mewn organynnau amrywiol wedi'u meintoli trwy feintioli heb ei labelu (n = 3 arbrawf biolegol annibynnol).Defnyddiwyd prawf t Myfyriwr dwy gynffon ar leiniau llosgfynydd.Defnyddiwyd math gwyllt HEK293T fel rheolaeth negyddol. Mae proteinau sydd wedi newid yn sylweddol yn cael eu hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth dwyster ïon ddwywaith). Mae proteinau sydd wedi newid yn sylweddol yn cael eu hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth dwyster ïon ddwywaith). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a >2-кратная разница в интенсивности). Mae proteinau sydd wedi'u newid yn sylweddol wedi'u hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth deublyg mewn dwyster ïon).p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной сил). Mae proteinau sydd wedi'u newid yn sylweddol wedi'u hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth deublyg mewn cryfder ïonig).Dangosir proteinau cysylltiedig sy'n bwysig ar gyfer HEK293T-miniSOG ond nad ydynt yn bwysig ar gyfer HEK293T mewn gwyrdd.e Dadansoddiad o benodolrwydd setiau data proteomig o arbrofion d.Mae cyfanswm y proteinau ystadegol arwyddocaol ym mhob organelle (smotiau coch a gwyrdd) wedi'i nodi ar y brig.Mae histogramau yn dangos proteinau wedi'u lleoleiddio mewn organynnau yn seiliedig ar MitoCarta 3.0, dadansoddiad GO ac A. Ting et al.pobl.Setiau data ar wahân ar gyfer mitocondria, niwclysau, ac ER.Ailadroddwyd yr arbrofion hyn yn annibynnol o leiaf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.Darperir data crai ar ffurf ffeiliau data crai.
Wedi'i annog gan y canlyniadau gel a delweddu, defnyddiwyd meintioli di-label i feintioli'r proteome a nodwyd ym mhob organelle (Data Atodol 2).Defnyddiwyd HEK293T heb ei drosglwyddo fel rheolaeth negyddol i dynnu marcwyr cefndir. Dangosodd dadansoddiad plot llosgfynydd broteinau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol (p < 0.05 a > dwyster ïon 2-plyg) yn ogystal â phroteinau singleton sydd ond yn bresennol mewn llinellau mynegi miniSOG (Ffig. 3d dotiau coch a gwyrdd). Dangosodd dadansoddiad plot llosgfynydd broteinau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol (p < 0.05 a > dwyster ïon 2-plyg) yn ogystal â phroteinau singleton sydd ond yn bresennol mewn llinellau mynegi miniSOG (Ffig. 3d dotiau coch a gwyrdd). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Dangosodd dadansoddiad plot llosgfynydd broteinau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol (p<0.05 a > dwyster ïon 2-plyg) yn ogystal â phroteinau sengl sydd ond yn bresennol mewn llinellau mynegi miniSOG (Ffig. 3d, dotiau coch a gwyrdd).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度）） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 的 单一 单一 （（图 图 3d 红色 红色 和 绿色点））。。火山图 分析 显示 显示 显着 的 蛋白质 （（p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （（图 3d 红色 绿色点 。。。 。。。））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Datgelodd dadansoddiad plot llosgfynydd broteinau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol (p<0.05 a>2x cryfder ïonig) yn ogystal â phroteinau sengl sydd ond yn bresennol yn y llinell fynegiant miniSOG (smotiau coch a gwyrdd yn Ffig. 3d).Gan gyfuno'r data hyn, fe wnaethom nodi 1364, 461, a 911 o broteinau pilen allanol niwclear, mitocondriaidd ac ER arwyddocaol yn ystadegol, yn y drefn honno.I ddadansoddi cywirdeb PDPL organelle-localized, defnyddiwyd dadansoddiad MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO), ac A. Ting et al.defnyddiwyd set ddata8 ar gyfer mitocondria, cnewyllyn, ac ER i brofi penodoldeb organelle y proteinau a ganfuwyd, sy'n cyfateb i gywirdeb o 73.4, 78.5, a 73.0% (Ffig. 3e).Mae penodoldeb PDPL yn cadarnhau bod PDPL yn arf delfrydol ar gyfer nodi proteomau organelle-benodol.Yn nodedig, dangosodd dadansoddiad ymostochondrial o broteinau mitocondriaidd a nodwyd fod y proteome wedi'i ddal wedi'i ddosbarthu'n bennaf yn y matrics a'r bilen fewnol (226 a 106, yn y drefn honno), gan gyfrif am 91.7% (362) o gyfanswm nifer y proteinau mitocondriaidd a nodwyd.cadarnhawyd lefel uchel o PDPL hefyd (Ffig Atodol 7a).Yn yr un modd, dangosodd dadansoddiad is-niwclear fod y proteome a ddaliwyd wedi'i ddosbarthu'n bennaf yn y cnewyllyn, niwcleoplasm, a niwcleolws (Ffig Atodol. 7b).Dangosodd dadansoddiad proteomig niwclear gyda peptid signal lleoleiddio niwclear (3xNLS) gywirdeb tebyg i'r H2B adeiladu (Atodol Ffig. 7c-h).Er mwyn pennu penodoldeb y marciwr PDPL, dewiswyd laminin niwclear A fel trap POI7 mwy lleoledig.Nododd PDPL 36 o broteinau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol, ac roedd 12 o broteinau (30.0% gan gynnwys lamin A) yn broteinau rhyngweithio lamin A â nodweddion da wedi'u hanodi gan gronfa ddata Llinynnol, gyda chanran uwch na'r dull BioID (122 proteinau) 28 o 28. , 22.9 %) 7. Nododd ein dull lai o broteinau, o bosibl oherwydd ardaloedd labelu cyfyngedig, a wnaed yn bosibl gan ocsigen sengl mwy gweithredol.Dangosodd dadansoddiad GO fod y proteinau a nodwyd wedi'u lleoli'n bennaf yn y niwcleoplasm (26), pilen niwclear (10), pilen niwclear (9), a mandyllau niwclear (5).Gyda'i gilydd, roedd y proteinau niwclear-leoledig hyn yn cyfrif am 80% o'r proteinau cyfoethog, gan ddangos ymhellach benodolrwydd PDPL (Ffig Atodol 8a-d).
Ar ôl sefydlu gallu PDPL i berfformio marcio agosrwydd mewn organynnau, gwnaethom wedyn brofi a ellid defnyddio PDPL i ddadansoddi partneriaid rhwymo POI.Yn benodol, ceisiwyd diffinio dadansoddiad PDPL o broteinau sytosolig, a ystyrir yn dargedau anoddach na'u cymheiriaid pilen-leoli oherwydd eu natur hynod ddeinamig.Mae'r bromodomain a'r protein allderfynol (BET) BRD4 wedi denu ein sylw am ei rôl allweddol mewn amrywiol glefydau 35, 36 .Mae'r cyfadeilad a ffurfiwyd gan BRD4 yn gydweithredol trawsgrifio ac yn darged therapiwtig pwysig.Trwy reoleiddio mynegiant ffactorau trawsgrifio c-myc ac Wnt5a, credir bod BRD4 yn benderfynydd allweddol o lewcemia myeloid acíwt (AML), myeloma lluosog, lymffoma Burkitt, canser y colon a chlefydau llidiol37,38.Yn ogystal, mae rhai firysau'n targedu BRD4 i reoleiddio trawsgrifio firaol a cellog, fel firws papiloma, HIV, a SARS-CoV-236,39.
I fapio'r rhyngweithiad BRD4 gan ddefnyddio PDPL, fe wnaethom gyfuno miniSOG ag isoform terfynell N- neu C byr o BRD4.Datgelodd canlyniadau proteomig lefel uchel o orgyffwrdd rhwng y ddau lun (Ffig Atodol 9a).Mae'r proteome niwclear a nodwyd gyda miniSOG-H2B yn cwmpasu 77.6% o'r proteinau sy'n rhyngweithio â BRD4 (Ffig Atodol 9b).Yna, defnyddiwyd gwahanol amseroedd goleuo (2, 5, 10, 20 munud) i addasu radiws y marciwr (Ffig. 4a a data atodol 3).Rydym yn dod i'r casgliad y bydd PDPL yn labelu partneriaid sy'n rhwymo'n uniongyrchol yn bennaf ar ffotogyfnodau byrrach, tra bydd cyfnodau hirach yn cynnwys proteinau a nodwyd yn ystod cyfnodau ffotoactifedd byrrach yn ogystal â thargedau anuniongyrchol mewn cyfadeiladau labelu.Mewn gwirionedd, canfuom orgyffwrdd cryf rhwng pwyntiau amser cyfagos (84.6% ar gyfer 2 a 5 munud; 87.7% ar gyfer 5 a 10 munud; 98.7% ar gyfer 10 a 20 munud) (Ffig. 4b a Ffig Atodol 9c).Ym mhob grŵp arbrofol, canfuom nid yn unig hunan-labelu BRD4, ond nifer o dargedau hysbys megis MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, a HMGB1 wedi'u hanodi yn y gronfa ddata llinynnol.Mae cryfder ïonig y targedau hyn yn gymesur â'r amser datguddio (Ffig. 4c a Ffig. Atodol 9d).Dangosodd dadansoddiad GO o'r proteinau a nodwyd yn y grŵp 2 funud fod y proteinau a nodwyd wedi'u lleoli yn y cnewyllyn a'u bod yn ymwneud ag ailfodelu cromatin a swyddogaeth RNA polymeras.Roedd swyddogaeth moleciwlaidd y protein yn cael ei gyfoethogi mewn rhwymiad cromatin neu gydweithrediad trawsgrifiadol, yn gyson â swyddogaeth BRD4 (Ffig. 4d).Datgelodd dadansoddiad rhyngweithio protein wedi'i alluogi gan gronfa ddata llinynnol lefel gyntaf o ryngweithio anuniongyrchol rhwng cyfadeiladau rhyngweithio teuluol BRD4 a HDAC megis SIN3A, NCOR2, BCOR, a SAP130 (Ffig. 4e a Ffig Atodol. 9e), yn gyson â histones asetylaidd rhwymo BRD4 a HDAC ..Yn ogystal, cadarnhawyd targedau cynrychioliadol a nodwyd gan LC-MS/MS, gan gynnwys Sin3A, NSUN2, Fus, a SFPQ, gan blotio'r Gorllewin (Ffig. 4f).Yn ddiweddar, adroddwyd bod isoform byr BRD4 yn ffurfio niwclysau gyda phriodweddau gwahanu cyfnod hylif-hylif (LLPS).Mae'r proteinau rhwymo RNA Fus a SFPQ yn cyfryngu'r LLPS o brosesau cellog amrywiol ac maent wedi'u nodi yma fel proteinau rhwymo BRD4 heb eu cofnodi.Cadarnhawyd y rhyngweithio rhwng BRD4 a SFPQ gan arbrofion cyd-imiwnedd (cyd-IP) (Ffigur 4g), gan awgrymu mecanwaith arall ar gyfer gwahanu cyfnod hylif-hylif wedi'i gyfryngu gan BRD4 sy'n haeddu ymchwiliad pellach.Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod PDPL yn llwyfan delfrydol ar gyfer nodi rhyngweithio BRD4 hysbys yn ogystal â phroteinau rhwymo anhysbys.
Cynrychiolaeth sgematig o farcio agosrwydd BRD4 wedi'i gyfryngu gan miniSOG, amseroedd amlygiad: 2, 5, 10, ac 20 mun.b Gorgyffwrdd proteinau a nodwyd ar adegau goleuo gwahanol.Roedd cyfoethogi protein a nodwyd yn HEK293T-miniSOG-BRD4 yn ystadegol arwyddocaol o'i gymharu â math gwyllt HEK293T.c Arddwysedd ïon wrth feintioli proteinau cynrychiadol heb eu labelu sy'n rhwymo BRD4 hysbys yn ystod yr amser datguddiad penodedig.n = 3 sampl fiolegol annibynnol.Cyflwynir data fel cymedrig ± gwyriad safonol.d Dadansoddiad ontolegol genynnol (GO) o broteinau a nodwyd yn y grŵp 2 funud.Rhestrir y deg term GO cyntaf.Mae swigod yn cael eu lliwio yn ôl categori term GO, ac mae maint swigen yn gymesur â nifer y proteinau a geir ym mhob tymor.e Dadansoddiad llinynnol o broteinau sy'n rhyngweithio â BRD4.Mae'r cylchoedd melyn yn glud uniongyrchol a'r cylchoedd llwyd yw'r haen gyntaf o glud anuniongyrchol.Mae'r llinellau coch yn cynrychioli'r rhyngweithiadau a bennwyd gan arbrawf ac mae'r llinellau glas yn cynrychioli'r rhyngweithiadau a ragwelir.f Gwiriwyd targedau rhwymol BRD4 cynrychioliadol a nodwyd yn LC-MS/MS gan blotio Gorllewinol.g Mae arbrofion cyd-imiwnedd yn cadarnhau'r rhyngweithio rhwng SFPQ a BRD4.Ailadroddwyd yr arbrofion hyn yn annibynnol o leiaf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.Darperir data crai ar ffurf ffeiliau data crai.
Yn ogystal â nodi targedau anghofrestredig sy'n gysylltiedig â POI, rydym yn damcaniaethu y bydd PDPL yn addas ar gyfer nodi swbstradau ar gyfer ensymau, a fyddai'n gofyn am nodweddu proteinau rhwymo anuniongyrchol mewn cyfadeiladau mawr i anodi swbstradau heb eu cofrestru.Mae Parkin (wedi'i amgodio gan PARK2) yn ligas E3 ac mae'n hysbys bod mwtaniadau mewn parkin yn achosi clefyd Parkinson ieuenctid enciliol awtosomaidd (AR-JP)42.Yn ogystal, disgrifiwyd parkin fel rhywbeth hanfodol ar gyfer mitoffagi (awtophagy mitochondrial) a chael gwared ar rywogaethau ocsigen adweithiol.Fodd bynnag, er bod sawl swbstrad parkin wedi'u nodi, mae rôl parkin yn y clefyd hwn yn parhau i fod yn aneglur.I anodi ei swbstradau annodweddiadol, profwyd PDPL trwy ychwanegu miniSOG at derfynfa N- neu C parkin.Cafodd celloedd eu trin â'r cludwr proton carbonyl cyanid m-clorophenylhydrazone (CCCP) i actifadu parkin trwy'r llwybr PINK1-Parkin.O'i gymharu â'n canlyniadau PDPL BRD4, datgelodd ymasiad N-terminus parkin set fwy o broteinau targed, er ei fod yn gorchuddio cyfran fwy o'r C-terminus (177 allan o 210) (Ffigur 5a,b a Data Atodol 4).mae'r canlyniad yn gyson ag adroddiadau y gall tagiau terfynell N actifadu Parkin44 yn afreolaidd.Yn syndod, dim ond 18 o broteinau gorgyffwrdd oedd yn ein data gyda chanlyniadau AP-MS cyhoeddedig ar gyfer Parkin43, yn debygol oherwydd gwahaniaethau rhwng llinellau celloedd a llifoedd gwaith proteomeg.Yn ogystal â phedwar protein hysbys (ARDM1, HSPA8, PSMD14, a PSMC3) a nodwyd gan ddau ddull (Ffig. 5c)43.I ddilysu canlyniadau LC-MS/MS ymhellach, defnyddiwyd triniaeth PDPL a blotio Gorllewinol dilynol i gymharu canlyniadau assay rhiant-gell HEK293T a'r llinell parkin sefydlog N-terminal.Profwyd targedau anhysbys yn flaenorol CDK2, DUT, CTBP1, a PSMC4 gyda rhwymwr hysbys, DNAJB1 (Ffig. 5d).
Llain llosgfynydd o broteinau parkin-rhyngweithiol mewn celloedd HEK293T gyda miniSOG wedi'i fynegi'n sefydlog wedi'i asio i derfynfa N- neu C parkin (n = 3 arbrawf biolegol annibynnol).Defnyddiwyd prawf t Myfyriwr dwy gynffon ar leiniau llosgfynydd.Defnyddiwyd HEK293T fel rheolaeth negyddol. Mae proteinau sydd wedi newid yn sylweddol yn cael eu hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth dwyster ïon ddwywaith). Mae proteinau sydd wedi newid yn sylweddol yn cael eu hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth dwyster ïon ddwywaith). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a >2-кратная разница в интенсивности). Mae proteinau sydd wedi'u newid yn sylweddol wedi'u hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth deublyg mewn dwyster ïon).p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной сил). Mae proteinau sydd wedi'u newid yn sylweddol wedi'u hamlygu mewn coch (p <0.05 a> gwahaniaeth deublyg mewn cryfder ïonig).Dangosir proteinau cysylltiedig sy'n bwysig ar gyfer HEK293T-miniSOG ond nad ydynt yn bwysig ar gyfer HEK293T mewn gwyrdd.b Diagram Venn yn dangos proteinau sy'n gorgyffwrdd rhwng lluniadau terfynell-N ac C-terminal.Gall tagiau terfynell N actifadu parkin yn afreolus ac arwain at broteinau mwy adnabyddadwy.c Diagram Venn yn dangos proteinau sy'n gorgyffwrdd rhwng PDPL ac AP-MS.Rhestrir rhyngweithyddion hysbys, gan gynnwys 4 o 18 o broteinau gorgyffwrdd ac 11 o 159 o broteinau a nodir yn benodol yn PDPL.d Gwiriwyd targedau cynrychioliadol a nodwyd gan LC-MS/MS gan blotio'r Gorllewin.e Nodwyd Ssu72 ac SNW1 fel swbstradau parkin anghofrestredig.Trosglwyddwyd y plasmidau protein hyn â thag FLAG i HEK293T a HEK293T-Parkin-miniSOG ac yna triniaeth CCCP ar wahanol adegau.Roedd y diraddiad yn fwy amlwg yn llinell gorfynegiant Parkin.f Gan ddefnyddio'r atalydd proteasome MG132, cadarnhawyd bod proses ddiraddio Ssu72 a SNW1 yn cael ei chyfryngu gan proteasome-ubiquitination.Ailadroddwyd yr arbrofion hyn yn annibynnol o leiaf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.Darperir data crai ar ffurf ffeiliau data crai.
Yn nodedig, rhaid i'r proteinau a nodir gan PDPL gynnwys proteinau sy'n rhwymo parkin a'u swbstradau.Er mwyn canfod swbstradau parkin anghofrestredig, dewiswyd saith protein a nodwyd gennym (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 a SNW1) a phlasmidau a drosglwyddwyd i amlygu'r genynnau hyn i HEK293T arferol a mynegi HEK293T miniSOG-Parkin yn sefydlog ac yna triniaeth CCCP.Gostyngwyd lefelau proteinau Ssu72 a SNW1 yn sylweddol yn y llinell sefydlog miniSOG-Parkin (Ffig. 5e).Arweiniodd triniaeth gyda CCCP am 12 awr at ddiraddiad mwyaf arwyddocaol y ddau swbstrad.Er mwyn ymchwilio i weld a yw diraddio Ssu72 a SNW1 yn cael ei reoleiddio gan proteasome-ubiquitination, ychwanegwyd yr atalydd proteasome MG132 i atal gweithgaredd proteasome, ac mewn gwirionedd canfuom fod eu proses ddiraddio wedi'i hatal (Ffig. 5f).Cadarnhawyd targedau di-swbstrad ychwanegol fel rhyngweithwyr Parkin gan ddefnyddio blotio Gorllewinol (Ffig Atodol 10), a ddangosodd ganlyniadau cyson ag LC-MS/MS.I gloi, mae integreiddio llif gwaith PDPL â dilysiad trawsgludiad protein targed yn caniatáu adnabod swbstradau ligas E3 heb eu cofrestru.
Rydym wedi datblygu llwyfan marcio agosrwydd cyffredin sy'n eich galluogi i nodi POIs sy'n rhyngweithio mewn gofod ac amser.Mae'r platfform yn seiliedig ar y protein ffotosensitizer miniSOG, sef dim ond tua 12 kDa, llai na hanner maint yr ensym APEX2 aeddfed (27 kDa) a thraean maint TurboID (35 kDa).Dylai'r maint llai ehangu'n fawr yr ystod o gymwysiadau ar gyfer astudio rhyngweithomau protein bach.Mae angen archwiliad pellach o ffotosensitizers ychwanegol, boed yn broteinau wedi'u hamgodio'n enetig neu'n foleciwlau bach, i gynyddu cynnyrch cwantwm ocsigen singlet ac ehangu sensitifrwydd y dull hwn.Ar gyfer y fersiwn gyfredol o miniSOG, gellir cyflawni cydraniad amser uchel trwy ddefnyddio golau glas i actifadu marcwyr agosrwydd.Yn ogystal, rhyddhaodd amser amlygiad hirach “gwmwl” mwy o ocsigen singlet, gan arwain at addasu mwy o weddillion histidine distal, mwy o radiws labelu, a'r gallu i fireinio cydraniad gofodol PDPL.Fe wnaethom hefyd brofi saith chwiliwr cemegol i gynyddu'r gymhareb signal-i-gefndir ac archwilio'r mecanwaith moleciwlaidd y tu ôl i'r dull hwn.Cadarnhaodd llif gwaith TOP-ABPP ynghyd â chwiliad agored diduedd mai dim ond mewn histidinau y digwyddodd addasiadau ac ni welwyd unrhyw ficro-amgylchedd cyson ar gyfer addasiadau histidine cynyddol, ac eithrio ffafriaeth gymedrol ar gyfer histidinau yn y rhanbarth dolen.
Mae PDPL hefyd wedi cael ei ddefnyddio i nodweddu proteomau isgellog gyda phenodoldeb a sylw proteome o leiaf yn debyg i labelu agosrwydd eraill a dulliau archwilio cemegol organelle-benodol.Mae marcwyr agosrwydd hefyd wedi'u defnyddio'n llwyddiannus i nodweddu'r proteomau arwyneb, lysosomaidd, a secretome-gysylltiedig46,47.Credwn y bydd PDPL yn gydnaws â'r organynnau isgellog hyn.Yn ogystal, gwnaethom herio PDPL trwy nodi targedau ar gyfer rhwymo protein sytosolig sy'n fwy cymhleth na phroteinau wedi'u rhwymo â philen oherwydd eu priodweddau deinamig a'u cyfranogiad mewn rhyngweithiadau mwy amserol.Cymhwyswyd PDPL i ddau brotein, y coactivator trawsgrifio BRD4 a'r ligas cysylltiedig â chlefyd E3 Parkin.Dewiswyd y ddau brotein hyn nid yn unig oherwydd eu swyddogaethau biolegol sylfaenol, ond hefyd oherwydd eu perthnasedd clinigol a'u potensial therapiwtig.Ar gyfer y ddau POIs hyn, nodwyd partneriaid rhwymol adnabyddus yn ogystal â thargedau anghofrestredig.Yn nodedig, cadarnhawyd y protein sy'n gysylltiedig â gwahanu cam SFPQ gan co-IP, a allai ddangos mecanwaith newydd y mae BRD4 (isofform byr) yn ei ddefnyddio i reoleiddio LLPS.Ar yr un pryd, credwn fod adnabod swbstradau Parkin yn senario lle mae angen adnabod gludyddion anuniongyrchol.Fe wnaethom nodi dwy swbstrad parkin anhysbys a chadarnhau eu bod yn diraddio ar hyd y llwybr hollbresennol-proteasom.Yn ddiweddar, datblygwyd strategaeth trapio ar sail mecanwaith i ganfod swbstradau hydrolase trwy eu trapio ag ensymau.Er bod hwn yn ddull pwerus iawn, nid yw'n addas ar gyfer dadansoddi swbstradau sy'n ymwneud â ffurfio cyfadeiladau mawr ac mae angen ffurfio bondiau cofalent rhwng yr ensym a'r swbstrad.Disgwyliwn y gellir ymestyn PDPL i astudio cyfadeiladau protein eraill a theuluoedd ensymau, megis y teuluoedd deubiquitinase a metalloprotease.
Mae math newydd o miniSOG, o'r enw SOPP3, wedi'i ddatblygu gyda chynhyrchiad ocsigen singlet gwell.Gwnaethom gymharu miniSOG â SOPP3 a chanfod perfformiad marcio gwell, er nad oedd y gymhareb signal-i-sŵn wedi newid (Ffig Atodol 11).Fe wnaethom ddamcaniaethu y byddai optimeiddio SOPP3 (ee, trwy esblygiad cyfeiriedig) yn arwain at broteinau ffotosensiteiddiwr mwy effeithlon sy'n gofyn am amseroedd golau byrrach ac felly'n caniatáu i brosesau cellog mwy deinamig gael eu dal.Yn nodedig, mae'r fersiwn gyfredol o PDPL yn gyfyngedig i'r amgylchedd cellog gan fod angen goleuo golau glas arno ac ni all dreiddio meinweoedd dwfn.Mae'r nodwedd hon yn atal ei ddefnyddio mewn astudiaethau model anifeiliaid.Fodd bynnag, gallai'r cyfuniad o optogeneteg â PDPL roi cyfle ar gyfer ymchwil anifeiliaid, yn enwedig yn yr ymennydd.Yn ogystal, mae ffotosensitizers isgoch peirianyddol eraill hefyd yn dileu'r cyfyngiad hwn.Mae ymchwil ar y gweill yn y maes hwn ar hyn o bryd.
Cafwyd llinell gell HEK293T gan ATCC (CRL-3216).Profodd y llinell gell yn negyddol am haint mycoplasma ac fe'i meithrinwyd yn DMEM (Thermo, #C11995500BT) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10% (FBS, Vistech, #SE100-B) ac 1% penisilin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).tyfu i mewn.
Prynwyd 3-Aminophenylene (sampl 3) a (4-ethynylphenyl)methanamine (sampl 4) gan Bidepharm.Prynwyd propylamine (probe 2) o Energy-chemicals.Cafodd N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) ei syntheseiddio yn unol â dulliau cyhoeddedig.
Mae Tabl Atodol 1 yn rhestru'r lluniadau genetig a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon.Cloniwyd y dilyniannau miniSOG a KillerRed o plasmid rhodd gan P. Zou (Prifysgol Peking).Roedd y dilyniant targedu matrics mitocondriaidd yn deillio o'r 23 asid amino N-terminal o COX4 a'i glonio i mewn i'r fectorau a nodwyd gan ddefnyddio cynulliad Gibson (Beyotime, #D7010S).Er mwyn targedu pilen a chnewyllyn y reticwlwm endoplasmig, mae DNA dynol SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) wedi'i chwyddo gan PCR o lyfrgell cDNA o gelloedd HEK293T, a H2B DNA (rhoddedig D. Lin, Labordy Bae Shenzhen) a chlonio , fel y crybwyllwyd uchod.Oni nodir yn wahanol, cafodd genynnau protein eraill a ddefnyddiwyd ar gyfer trawsgludo ac adeiladu llinellau celloedd sefydlog eu chwyddo PCR o lyfrgell cDNA cell HEK293T.Defnyddiwyd G3S (GGGS) a G4S (GGGGS) fel cysylltwyr rhwng y protein abwyd a miniSOG.Ychwanegwyd tag epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) at y lluniadau ymasiad hyn.Ar gyfer mynegiant mewn mamaliaid ac i sefydlu llinell gell sefydlog, is-gloniwyd lluniad ymasiad miniSOG i fector lentifeirws pLX304.Ar gyfer mynegiant bacteriol, cafodd miniSOG ei glonio i mewn i'r fector pET21a wedi'i labelu 6xHis yn y C-terminus.
Cafodd celloedd HEK293T eu hadu ar 2.0 x 105 o gelloedd y ffynnon mewn platiau chwe ffynnon a'u trawsgyfeirio 24 awr yn ddiweddarach gyda phlasmidau lentifeirws ailgyfunol (2.4 μg pLX304) a phlasmidau pecynnu firaol (1.5 μg psPAX2 a 1.2 μg pLX300) gan ddefnyddio Li2Beo. , #C0533), tua 80% ymasiad.Ar ôl trawsnewid dros nos, cafodd y cyfrwng ei newid a'i ddeor am 24 awr arall.Cafodd y firws ei gasglu ar ôl 24, 48 a 72 awr.Cyn i'r llinellau celloedd targed gael eu heintio, cafodd y cyfrwng firaol ei hidlo trwy hidlydd 0.8 μm (Merck, #millex-GP) ac ychwanegwyd polybren (Solarbio, #H8761) at grynodiad o 8 μg/ml.Ar ôl 24 awr, caniatawyd i'r celloedd wella trwy newid y cyfrwng.Dewiswyd celloedd gan ddefnyddio blasticidin 5 μg/ml (Solarbio, #3513-03-9) ar gyfer y tri darn cyntaf fel detholiad llym is.Yna defnyddio 20 μg/ml fel regimen llymach ar gyfer y tri darn nesaf.
Cafodd celloedd eu hadu mewn siambrau 12 ffynnon (Ibidi, #81201) ar ddwysedd o tua 20,000 o gelloedd fesul ffynnon.Er mwyn gwella adlyniad celloedd HEK293T, ychwanegwch 50 µg/ml ffibronectin (Corning, #356008) wedi'i wanhau mewn halwynog byffer ffosffad (PBS, Sangon, #B640435) ar 37 ° C.Cafodd y siambrau eu trin ymlaen llaw am 1 awr ac yna eu tynnu gyda PBS.Ar ôl 24 h, golchwyd celloedd unwaith gyda PBS, eu deor â stiliwr 1 mM 3 mewn hydoddiant halen cytbwys Hanks ffres (HBSS, Gibco, #14025092) am 1 h ar 37 ° C, ac yna eu deor â LED glas (460 nm). ).) wedi'u harbelydru am 10 munud ar dymheredd ystafell.Ar ôl hynny, golchwyd y celloedd ddwywaith gyda PBS a'u gosod gyda 4% o fformaldehyd yn PBS (Sangon, #E672002) am 15 munud ar dymheredd ystafell.Tynnwyd gormod o fformaldehyd o gelloedd sefydlog trwy olchi tair gwaith gyda PBS.Yna cafodd celloedd eu treiddio â 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) yn PBS a'u golchi 3 gwaith gyda PBS.Yna tynnwch y siambr ac ychwanegwch at bob sampl 25 µl o gymysgedd adwaith clicio sy'n cynnwys 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) a 0.5 mg/ml ascorbate sodiwm (Aladdin, rhif S105024) a'i ddeor am 30 munud ar dymheredd ystafell.Ar ôl adwaith sydyn, golchwyd celloedd chwe gwaith gyda PBS yn cynnwys 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ac yna eu blocio â 5% BSA (Abcone, #B24726) yn PBST am 30 munud ar dymheredd yr ystafell.
Ar gyfer gwrthimiwnedd colocalization, deorwyd celloedd â gwrthgyrff cynradd yn unol â'r amodau a nodwyd: tag gwrth-V5 llygoden mAb (1:500, CST, #80076), cwningen gwrth-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), gwrthgorff gwrth-calnexin polyclonaidd cwningen (1:500, Abcam, #ab22595) neu wrthgorff monoclonaidd gwrth-lamin cwningen A/C (1:500; CST, #2032) ar 4 ° C dros nos.Ar ôl golchi 3 gwaith gyda PBST, cafodd celloedd eu deor â gwrthgyrff eilaidd: gwrth-gwningen gafr Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) gwanhau 1:1000, gwrth-lygoden gafr Alexa Fluor 594 (CST, #8889) gwanhau 1:1000.gwanhau Gwanedwch ar dymheredd ystafell am 30 munud.Yna cafodd celloedd eu golchi 3 gwaith gyda PBST a'u gwrth-staenio â DAPI (Thermo, #D1306) yn PBS am 10 munud ar dymheredd ystafell.Ar ôl golchi 3 gyda PBS, seliwyd celloedd mewn 50% glyserol (Sangon, #A600232) yn PBS ar gyfer delweddu.Cafwyd delweddau imiwnofflworoleuol gan ddefnyddio microsgop confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 a meddalwedd ZNE 3.5.
Ar gyfer delweddu fflwroleuol ocsigen singlet, golchwyd celloedd ddwywaith gyda byffer Hanks HEPES cyn ychwanegu 100 nM Si-DMA mewn byffer Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Ar ôl dod i gysylltiad â golau, cafodd y celloedd eu deor mewn deorydd CO2 ar 37°C am 45 munud.Yna golchwyd celloedd ddwywaith gyda byffer HEPES Hanks a'u gwrth-staenio â byffer HEPES Hoechst yn Hanks am 10 munud ar dymheredd ystafell a'u delweddu gan ddefnyddio microsgop confocal ZEISS LSM 900., #M36008) mewn byffer HBSS sy'n cynnwys calsiwm a magnesiwm.Ar ôl dod i gysylltiad â golau neu doxorubicin (MCE, #HY-15142A), deorwyd celloedd mewn deorydd CO2 ar 37 ° C. am 10 munud, eu golchi ddwywaith gyda byffer HBSS, a'u deor gyda Hoechst mewn byffer HBSS ar dymheredd ystafell.munudau.Defnyddiwyd doxorubicin fel rheolydd stiliwr positif lle cafodd celloedd eu trin â doxorubicin 20 μM mewn HBSS yn cynnwys 1% BSA am 30 munud.Cafwyd delweddau imiwnofflworoleuol gan ddefnyddio microsgop confocal Zeiss LSM 900.
Cafodd celloedd HEK293T sy'n mynegi mito-miniSOG yn sefydlog eu hadu ar ddwysedd o tua 30% mewn dysglau 15 cm.Ar ôl 48 awr, pan gyrhaeddwyd ~ 80% o gydlifiad, golchwyd y celloedd unwaith gyda PBS, eu deor â 1 mM Probe 3 mewn byffer HBSS ffres i mewn am 1 awr ar 37 ° C ac yna eu goleuo â LED glas am 10 munud yn yr ystafell. tymheredd..Wedi hynny, cafodd y celloedd eu golchi ddwywaith gyda PBS, eu crafu a'u hailddarparu mewn byffer PBS oer iâ sy'n cynnwys atalyddion proteas di-EDTA (MCE, #HY-K0011).Celloedd eu lysed gan sonicating y domen am 1 munud (1 eiliad ar ac 1 eiliad i ffwrdd ar 35% osgled).Cafodd y cymysgedd a ddeilliodd ohono ei allgyrchu ar 15,871 xg am 10 munud ar 4 ° C i gael gwared ar falurion, ac addaswyd y crynodiad supernatant i 4 mg/mL gan ddefnyddio pecyn profi protein BCA (Beyotime, #P0009).Cyfunwch 1 ml o'r lysate uchod â 0.1 mM azide biotin ffotoddiraddadwy (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), ligand TBTA 0.1 mM (Aladdin, #T162437), ac 1 mM CuSO4 incubator gyda gwaelod cylchdroi i fyny am 1 awr ar dymheredd ystafell.Ar ôl adwaith snap, ychwanegwch y cymysgedd i'r hydoddiant wedi'i gymysgu ymlaen llaw (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) mewn ffiol wydr 10 ml.Cymysgwyd y samplau a'u centrifugio ar 4500 g am 10 munud ar dymheredd ystafell.Taflwyd yr hydoddiannau isaf ac uchaf, golchwyd y gwaddod ddwywaith gydag 1 ml o fethanol a'i allgyrchu ar 15871 × g am 5 munud ar 4 ° C.Ychwanegu 1 ml o 8 M wrea (Aladdin, rhif. U111902) mewn bicarbonad amoniwm 25 mM (ABC, Aladdin, rhif A110539) i doddi'r gwaddod.Cafodd samplau eu hailgyfansoddi gyda 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 yn 25 mM ABC) am 40 munud ar 55°C ac yna ychwanegu iodoacetamid ffres 15 mM (Sangon, #A600539) ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch.Alkylation o fewn 30 munud..Ychwanegwyd dithiothreitol 5 mM ychwanegol i atal yr adwaith.Paratowch tua 100 µl gleiniau agarose NeutrAvidin (Thermo, #29202) ar gyfer pob sampl trwy olchi 3 gwaith gydag 1 ml PBS.Gwanhawyd yr hydoddiant proteome uchod â 5 ml PBS a'i ddeor â gleiniau agarose NeutrAvidin wedi'u golchi ymlaen llaw am 4 awr ar dymheredd ystafell.Yna golchwyd y gleiniau 3 gwaith gyda 5 ml PBS yn cynnwys 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 gwaith gyda 5 ml PBS yn cynnwys wrea 1M, a 3 gwaith gyda 5 ml ddH2O.Yna cynaeafwyd y gleiniau trwy allgyrchu a'u hailddarparu mewn 200 μl o 25 mM ABC yn cynnwys 1 M wrea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) a 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize dros nos ar 37°C gyda chylchdroi.Stopiwyd yr adwaith trwy ychwanegu asid fformig (Thermo, # A117-50) nes i'r pH gyrraedd 2-3.Golchwyd y gleiniau 3 gwaith gydag 1 ml o PBS yn cynnwys 0.2% SDS, 3 gwaith gydag 1 ml o PBS yn cynnwys 1 M wrea, ac yna 3 gwaith gydag 1 ml o ddŵr distyll.Rhyddhawyd y peptidau wedi'u haddasu gan lysis ysgafn (365 nm) am 90 munud gan ddefnyddio 200 μl o 70% MeOH.Ar ôl centrifugation, casglwyd y supernatant.Yna golchwyd y gleiniau unwaith gyda 100 μl o 70% MeOH a chafodd y supernatants eu cronni.Sychwyd samplau mewn crynodwr gwactod Speedvac a'u storio ar -20 ° C tan ddadansoddiad.
Er mwyn nodi a meintioli peptidau wedi'u haddasu ag ocsigen singlet, ail-hydoddwyd samplau mewn 0.1% o asid fformig a dadansoddwyd 1 μg o beptidau gan ddefnyddio sbectromedr màs Orbitrap Fusion Lumos Tribrid wedi'i gyfarparu â ffynhonnell nano ESI o Tune a Xcalibur o feddalwedd gwerthwr 4.3.Gwahanwyd samplau ar golofn capilari 75 µm × 15 cm wedi'i phacio'n fewnol gyda deunydd 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) a'u cysylltu â system EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Gwahanwyd y peptidau gan gromatograffeg graddiant llinol 95 munud o 8% toddydd B i 50% toddydd B (A = 0.1% asid fformig mewn dŵr, B = 0.1% asid fformig mewn 80% acetonitrile), yna cynyddodd yn llinol i 98% B min mewn 6 munud ar gyfradd llif o 300 nl/munud.Mae Orbitrap Fusion Lumos yn casglu data bob yn ail rhwng sgan MS llawn a sgan MS2 yn dibynnu ar y data.Gosodwyd y foltedd sputtering i 2.1 kV a thymheredd y capilari cludo ïon oedd 320 ° C.Casglwyd sbectra MS (350-2000 m/z) gyda chydraniad o 120,000, AGC 4 × 105, ac uchafswm amser mewnbwn o 150 ms.Roedd y 10 rhagflaenydd lluosrif mwyaf cyffredin ym mhob sgan llawn yn dameidiog gan ddefnyddio HCD gydag egni gwrthdrawiad normaleiddio o 30%, ffenestr ynysu pedwarplyg o 1.6 m/z, a gosodiad cydraniad o 30,000.Targed AGC ar gyfer sbectrometreg màs tandem gan ddefnyddio 5×104 ac uchafswm amser mewnbwn 150 ms.Mae'r eithriad deinamig wedi'i osod i 30 eiliad. Cafodd ïonau heb eu neilltuo neu'r rhai â gwefr o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS. Cafodd ïonau heb eu neilltuo neu'r rhai â gwefr o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Cafodd ïonau neu ïonau heb eu neilltuo â gwefr o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliciwch i weld mwy o luniau MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliciwch i weld mwy o luniau MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Cafodd ïonau neu ïonau amhenodol â gwefrau o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS.
Mae'r data crai yn cael ei brosesu gan ddefnyddio llwyfan cyfrifiadurol FragPipe yn seiliedig ar MSFragger.Penderfynwyd ar ragfarnau màs ac asidau amino cyfatebol gan ddefnyddio algorithm chwilio agored gyda goddefgarwch màs rhagflaenol o -150 i 500 Da.Yna nodwyd peptidau wedi'u haddasu gan ddefnyddio addasiadau histidine gydag enillion màs o +229.0964 a +247.1069 Da mewn PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Roedd celloedd sy'n mynegi'r genyn miniSOG ymdoddedig yn sefydlog wedi'u platio mewn dysglau 6 cm.Ar ôl cyrraedd cydlifiad ~80%, golchwyd celloedd unwaith gyda HBSS (Gibco, #14025092), yna eu deor â stilwyr cemegol yn HBSS am 1 awr ar 37 ° C a'u goleuo â golau glas.10W LED am 20 munud ar dymheredd ystafell.I benderfynu pa fath o rywogaethau ocsigen adweithiol sy'n ymwneud â PDPL, fitamin C 0.5 mM (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Ychwanegwyd manitol 100 mM (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 at y celloedd fel atchwanegiadau.Ar ôl golchi gyda PBS oer, crafu celloedd, a gasglwyd mewn tiwbiau centrifuge 1.5 ml, a sonicated gyda blaen am 1 munud mewn 200 μl o PBS gyda atalydd proteas 1x heb EDTA (1 s a 1 s heb, osgled 35%).Cafodd y cymysgedd canlyniadol ei allgyrchu ar 15,871 × g am 10 munud ar 4 ° C ac addaswyd y crynodiad uwchnatur i 1 mg/ml gan ddefnyddio pecyn profi protein BCA.Deorwyd tua 50 µl o'r lysate uchod â 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, rhif T131368), TCEP 1 mM, ligand TBTA 0.1 mM, ac 1 mM CuSO4 am 1 awr ar dymheredd ystafell gyda chylchdroi o'r gwaelod i'r brig.Ar ôl yr adwaith clicio, gwnaed dyddodiad ag aseton trwy ychwanegu 250 μl o aseton wedi'i oeri ymlaen llaw at y samplau, gan ddeor ar -20 ° C am 20 munud a chanrifu ar 6010 × g am 10 munud ar 4 ° C.Casglwch y belen a berwch mewn 50 µl o byffer 1x Laemmli am 10 munud ar 95 °C.Yna dadansoddwyd samplau ar geliau hir SDS-PAGE a'u delweddu gan ddefnyddio system ddelweddu Bio-rad ChemiDoc MP Touch gyda meddalwedd Image Lab Touch.
Perfformiwyd mynegiant a phuro'r protein miniSOG-6xHis ailgyfunol fel y disgrifiwyd yn flaenorol.Yn gryno, trawsnewidiwyd celloedd E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) â pET21a-miniSOG-6xHis a ysgogwyd mynegiant protein gyda 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Ar ôl lysis celloedd, cafodd proteinau eu puro gan ddefnyddio gleiniau agarose Ni-NTA (MCE, rhif 70666), eu dialyzed yn erbyn PBS, a'u storio ar -80 ° C.
Ar gyfer assay agosrwydd label in vitro sy'n seiliedig ar wrthgyrff, cymysgwch 100 μM miniSOG wedi'i buro, chwiliwr 1 mM 3, ac 1 μg gwrthgorff monoclonaidd llygoden gwrth-label (TransGen, #HT501-01) yn PBS i gyfanswm cyfaint adwaith o 50 μl..Cafodd cymysgedd yr adwaith ei arbelydru â golau LED glas am 0, 2, 5, 10, ac 20 munud ar dymheredd ystafell.Deorwyd y gymysgedd â 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), TCEP 1 mM, ligand TBTA 0.1 mM, ac 1 mM CuSO4 am 1 h ar dymheredd ystafell ar siglwr symud i fyny.Ar ôl adwaith sydyn, ychwanegwch 4x byffer Laemmli yn uniongyrchol i'r cymysgedd a'i ferwi ar 95 ° C am 10 munud.Dadansoddwyd samplau ar geliau SDS-PAGE a'u dadansoddi trwy blotio gorllewinol gyda streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
Defnyddiwyd peptid synthetig sy'n cynnwys histidine gydag amidation C-terminal (LHDALDAK-CONH2) i ddadansoddi labelu in vitro yn seiliedig ar peptid gerllaw.Yn y assay hwn, cymysgwyd 100 μM miniSOG puro, chwiliwr 10 mM 3 a 2 μg/ml peptid synthetig yn PBS mewn cyfanswm cyfaint adwaith o 50 μl.Cafodd cymysgedd yr adwaith ei arbelydru â golau LED glas am 1 awr ar dymheredd yr ystafell.Dadansoddwyd un microliter o sampl gan ddefnyddio system LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight sbectromedr màs gyda meddalwedd dadansoddi sbectrwm MassLynx).
Cafodd celloedd HEK293T sy'n mynegi'r genyn ymasiad miniSOG yn sefydlog eu hadu mewn dysglau 10 cm ar gyfer llinellau gyda gwahanol leoleiddiad organelle (Mito, ER, Nucleus) a seigiau 15 cm ar gyfer llinellau Parkin-miniSOG a BRD4-miniSOG.Ar ôl cyrraedd cydlifiad ~ 90%, golchwyd y celloedd unwaith gyda HBSS, yna eu deor â stiliwr 3 yn HBSS am 1 awr ar 37 ° C a'u goleuo â LED glas 10 W ar dymheredd yr ystafell.Ar gyfer labelu di-gyswllt Parkin, ychwanegwyd cludwr carbonyl cyanid 10 µM proton m-clorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) gyda stiliwr 3 yn HBSS am 1 awr ar 37 ° C.Roedd y camau lysis cell, cemeg clic, lleihau a alkylation yr un fath â'r rhai a ddisgrifir uchod, ac eithrio bod 2 mg o lysate wedi'i ychwanegu a defnyddiwyd biotin PEG3 azide yn yr adwaith clicio yn lle biotin azide ffotoddiraddadwy.Ar ôl cyfoethogi, golchwyd y gleiniau 3 gwaith gyda 5 ml o PBS yn cynnwys 0.2% SDS, 3 gwaith gyda 5 ml o PBS sy'n cynnwys wrea 1 M, a 3 gwaith gyda 5 ml o PBS.Wedi hynny, ychwanegwyd 2 µg trypsin at 300 µl 25 mM ABC yn cynnwys 1 M wrea i hollti’r protein dros nos ar 37°C.Stopiwyd yr adwaith trwy ychwanegu asid fformig nes cyrraedd pH o 2-3.Ar ôl trypsineiddio ar gleiniau, dihalwynwyd yr hydoddiant peptid gan ddefnyddio colofn HRP SOLAµ (Thermo, #60209-001) a'i sychu mewn crynhöwr gwactod Speedvac.Ail-hydoddwyd peptidau mewn 0.1% o asid ffurfig a dadansoddwyd 500 ng o beptidau gan ddefnyddio sbectromedr màs Orbitrap Fusion Lumos Tribrid gyda'r ffynhonnell nano-ESI a ddisgrifir uchod.Gwahanwyd peptidau ar rag-golofnau RP-HPLC masnachol (75 μm x 2 cm) (Thermo, rhif 164946) a cholofnau RP-HPLC dadansoddol (75 μm x 25 cm) (Thermo, rhif 164941), y ddau wedi'u llenwi â 2 μm.graddiant o 8% i 35% ACN mewn 60 munud, yna cynyddodd yn llinol i 98% B mewn 6 munud ar gyfradd llif o 300 Nl/munud.Casglwyd sbectra MS (350-1500 m/z) gyda chydraniad o 60,000, AGC 4 × 105, ac uchafswm amser mewnbwn o 50 ms.Cafodd ïonau dethol eu darnio'n ddilyniannol gan HCD mewn cylchoedd 3 s gydag egni gwrthdrawiad normaleiddio o 30%, ffenestr ynysu pedwarplyg o 1.6 m/z, a datrysiad o 15000. Targed AGC sbectromedr màs tandem 5 × 104 ac uchafswm amser pigiad o 22 ms yn cael eu defnyddio.Mae'r gwaharddiad deinamig wedi'i osod i 45 eiliad. Cafodd ïonau heb eu neilltuo neu'r rhai â gwefr o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS. Cafodd ïonau heb eu neilltuo neu'r rhai â gwefr o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Cafodd ïonau neu ïonau heb eu neilltuo â gwefr o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliciwch i weld mwy o luniau MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliciwch i weld mwy o luniau MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Cafodd ïonau neu ïonau amhenodol â gwefrau o 1+ a >7+ eu gwrthod ar gyfer MS/MS.
Roedd y camau paratoi sampl hyd at gyfoethogi'r gleiniau NeutrAvidin yr un fath ag yn y dadansoddiad LC-MS/MS a ddisgrifir uchod.Defnyddiwyd tua 50 μg o lysate fel mewnbwn ar gyfer rheoli llwytho a defnyddiwyd 2 mg o lysate ar gyfer adweithiau clicio.Ar ôl cyfoethogi a golchi â neutravidin, cafodd y proteinau wedi'u rhwymo eu hanwybyddu trwy ychwanegu 50 μl o glustogfa Laemmli i'r gleiniau resin agarose a'u berwi ar 95 ° C. am 5 munud.Dadansoddwyd mewnbwn llwyth rheoli a samplau wedi'u cyfoethogi â gleiniau gan SDS-PAGE a'u trosglwyddo i bilenni PVDF (Millipore, #ISEQ00010) trwy ddulliau blot safonol y Gorllewin.Cafodd y pilenni eu rhwystro â 5% o laeth sgim (Sangon, #A600669) mewn TBS yn cynnwys 0.1% tween-20 (TBST) a'u deor yn olynol â gwrthgyrff cynradd ac eilaidd.Cafodd gwrthgyrff cynradd eu gwanhau 1:1000 mewn llaeth sgim 5% mewn TBST a'u deor dros nos ar 4°C.Defnyddiwyd gwrthgyrff eilaidd mewn cymhareb o 1:5000 a'u deor am 1 awr ar dymheredd ystafell.Delweddwyd y pilenni gan gemioleuedd gan ddefnyddio system ddelweddu AS Chemidoc.Mae'r holl sganiau heb eu torri o blotiau a geliau yn y ffigwr yn cael eu cyflwyno fel data crai.
Roedd gwrthgyrff cynradd a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn cynnwys gwrthgorff monoclonaidd gwrth-SFPQ cwningen (CST, rhif 71992), gwrthgorff monoclonaidd gwrth-FUS cwningen (CST, rhif 67840), gwrthgorff polyclonaidd gwrth-NSUN2 cwningen (Proteintech, rhif 20854-1-) AP), gwrthgorff polyclonaidd gwrth-mSin3A cwningen (Abcam, #ab3479), gwrthgorff monoclonaidd gwrth-tag llygoden (TransGen, #HT201-02), gwrthgorff monoclonaidd gwrth-β-actin llygoden (TransGen, #HC201-01), gwrthgorff cwningen -CDK2 gwrthgorff monoclonaidd (ABclonal, #A0094), gwrthgorff monoclonaidd cwningen i CTBP1 (ABclonal, #A11600), gwrthgorff polyclonal cwningen i DUT (ABclonal, #A2901), gwrthgorff polyclonal cwningen i PSMC4 (ABclonal, #A2505), cwningen gwrth- Gwrthgorff polyclonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Defnyddiwyd y gwrthgyrff hyn ar wanediad o 1:1000 mewn llaeth sgim 5% mewn TBST.Roedd y gwrthgyrff eilaidd a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn cynnwys IgG gwrth-gwningen (TransGen, #HS101-01), IgG gwrth-lygoden (TransGen, #HS201-01) ar wanediad o 1:5000.
Er mwyn ymchwilio ymhellach i weld a yw BRD4 yn rhyngweithio â SFPQ, gosodwyd celloedd sefydlog HEK293T a BRD4-miniSOG sy'n gorfynegi HEK293T mewn dysglau 10 cm.Cafodd celloedd eu golchi â PBS oer a'u gosod mewn byffer lysis Pierce IP 1 ml (Thermo Fisher, #87787) gydag atalydd proteas heb EDTA am 30 munud ar 4°C.Ar ôl hynny, casglwyd y lysadau mewn tiwbiau allgyrchu 1.5 ml a'u centrifugio ar 15,871 xg am 10 munud ar 4 ° C.Cynaeafwyd y supernatant a'i ddeor â 5 µg o wrthgorff monoclonaidd llygoden gwrth-V5 (CST, #80076) dros nos ar 4°C.Golchwch tua 50 µl o gleiniau magnetig protein A/G (MCE, #HY-K0202) ddwywaith gyda PBS yn cynnwys 0.5% Tween-20.Yna deorwyd y lysates cell gyda gleiniau magnetig am 4 awr ar 4 ° C gyda chylchdroi o'r gwaelod i'r brig.Yna golchwyd y gleiniau bedair gwaith gyda 1 ml o byffer PBST a'u berwi ar 95 ° C am 5 munud.Dadansoddwyd samplau ar geliau SDS-PAGE a'u trosglwyddo i bilenni PVDF gan ddefnyddio dulliau blotio safonol y Gorllewin.Cafodd y pilenni eu rhwystro mewn llaeth sgim 5% mewn TBST a'u deor yn olynol â gwrthgyrff cynradd ac eilaidd.Defnyddiwyd gwrthgorff monoclonaidd gwrth-gyrff sylfaenol cwningen gwrth-SFPQ (CST, #71992) ar gymhareb o 1:1000 mewn llaeth sgim 5% mewn TBST a'i ddeor dros nos ar 4°C.Defnyddiwyd IgG gwrth-gwningen ar gymhareb o 1:5000 a'i ddeor am 1 awr ar dymheredd ystafell.Delweddwyd y pilenni gan gemioleuedd gan ddefnyddio system ddelweddu AS Chemidoc.
Cafwyd yr holl strwythurau a ddefnyddiwyd ar gyfer dadansoddiad Arwynebedd Arwyneb Hygyrch Toddyddion (SASA) o'r Banc Data Protein (PDB)52 neu Gronfa Ddata Strwythur Protein AlphaFold53.Cyfrifwyd SASA absoliwt ar gyfer pob gweddill gan ddefnyddio rhaglen FreeSASA.Dim ond data SASA cyflawn a diamwys ar gyfer histidine wedi'i labelu a'i gymdogion a ddefnyddiwyd i gael y SASA cymedrig ar gyfer pob strwythur.Cyfrifwyd yr hygyrchedd toddyddion cymharol (RSA) ar gyfer pob histidin trwy rannu'r gwerth SASA absoliwt â'r arwynebedd arwyneb gweddillion empirig mwyaf posibl sydd ar gael i'r toddydd.Yna dosbarthwyd pob histidin yn gudd os oedd yr RSA cymedrig o dan 20%, fel arall yn agored56.
Chwiliwyd ffeiliau crai a gafwyd yn y modd DDA gan ddefnyddio Proteome Discoverer (v2.5) neu MSfragger (Fragpipe v15.0) yn y gronfa ddata protein briodol wedi'i dilysu gan SwissProt sy'n cynnwys halogion cyffredin.Roedd angen trypsin cyflawn ar y peptidau gyda dau safle holltiad coll, methylation carbamoyl fel addasiad sefydlog ac ocsidiad methionin fel addasiad deinamig.Gosodwyd goddefiannau pwysau rhagflaenydd a darn i 10 ppm a 0.02 Da (MS2 Orbitrap), yn y drefn honno. Tynnwyd trawiadau halogion, a chafodd proteinau eu hidlo i gael cyfradd darganfod ffug o <1%. Tynnwyd trawiadau halogion, a chafodd proteinau eu hidlo i gael cyfradd darganfod ffug o <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коЍожони компании Tynnwyd trawiadau halogion a hidlwyd proteinau i roi cyfradd canfod ffug o <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложения уровня ложения ложения уровня ложания. Tynnwyd trawiadau halogion a hidlwyd proteinau i gyflawni cyfradd positif ffug o <1%.Ar gyfer dadansoddiad meintiol heb ddefnyddio labeli, defnyddiwyd cynnwys protein wedi'i normaleiddio o dri ailadrodd biolegol.Perfformiwyd dadansoddiad lleoleiddio isgellog protein gan ddefnyddio dadansoddiad Gene Ontology (GO) gan DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 a chronfeydd data a luniwyd ac a gyhoeddwyd gan grŵp Alice Ting.Cafwyd y map llosgfynydd gan Perseus (v1.6.15.0). Profwyd newidiadau plygiad helaethrwydd protein am arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio prawf-t dwy ochr, a nodwyd trawiadau protein gyda newid helaethrwydd >2 (oni nodir yn wahanol) a gwerth p <0.05. Profwyd newidiadau plygiad helaethrwydd protein am arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio prawf-t dwy ochr, a nodwyd trawiadau protein gyda newid helaethrwydd >2 (oni nodir yn wahanol) a gwerth p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Profwyd newidiadau plygiad cynnwys protein ar gyfer arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio prawf-t dwy gynffon, a nodwyd cyfatebiadau protein â newid cynnwys >2 (oni nodir yn wahanol) a gwerth ap <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化 变化> 2 （除非 另 有 说明）） 和 p 值 <0.05。使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 的 变化 变化> 2 （另 有 说明） 和 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Profwyd arwyddocâd ystadegol newidiadau plyg mewn cynnwys protein gan ddefnyddio prawf-t dwy gynffon, a phenderfynwyd cyfatebion protein ar gyfer newidiadau cynnwys >2 (oni nodir yn wahanol) a gwerthoedd-p <0.05.Perfformiwyd dadansoddiad rhyngweithio protein gan ddefnyddio dadansoddiad GO ynghyd â chronfa ddata Llinynnol.
Cyflawnwyd tri atgynhyrchiad biolegol gyda chanlyniadau tebyg.Gwnaed dadansoddiad ystadegol gyda GraphPad Prism (meddalwedd GraphPad) a chynhyrchwyd lleiniau llosgfynydd gyda Perseus (v1.6.15.0).I gymharu’r ddau grŵp, pennwyd gwerthoedd-p gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr dwy gynffon.Dim ond proteinau singleton a nodwyd o leiaf ddwywaith yn y grŵp arbrofol a gynhwyswyd yn y lleiniau llosgfynydd, a disodlwyd y gwerthoedd coll cyfatebol yn y grŵp rheoli â Perseus o ddosbarthiad arferol fel y gellid cyfrifo'r gwerth-p.Mae bariau gwall yn cynrychioli'r gwyriad safonol cymedrig ±.Mewn dadansoddiadau proteomig ar gyfer dadansoddiad ystadegol, cadwyd y doreth o broteinau a ymddangosodd mewn o leiaf ddau atgynhyrchiad biolegol.Ni ddefnyddiwyd dulliau ystadegol i rag-benderfynu maint y sampl.Nid yw'r arbrofion ar hap.Nid oedd yr ymchwilwyr yn ddall i'r tasgau yn ystod yr arbrawf a gwerthuso'r canlyniadau.
I gael rhagor o wybodaeth am gynllun yr astudiaeth, gweler crynodeb yr Adroddiad Ymchwil Natur sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon.
Cyflwynwyd y data sbectrometreg màs a gafwyd yn yr astudiaeth hon i Gonsortiwm ProteomeXchange trwy ystorfa bartner iProX57 o dan set ddata ID PXD034811 (set ddata PDPL-MS).Darperir data crai ar ffurf ffeiliau data crai.Mae'r erthygl hon yn darparu'r data gwreiddiol.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Dod i adnabod y gymdogaeth: defnyddio biotinylation sy'n dibynnu ar agosrwydd i nodweddu cymhlygion protein a mapio organynnau. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Dod i adnabod y gymdogaeth: defnyddio biotinylation sy'n dibynnu ar agosrwydd i nodweddu cymhlygion protein a mapio organynnau.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Cyfarwydd â'r amgylchoedd: defnyddio biotinylation sy'n dibynnu ar agosrwydd i nodweddu cymhlygion protein a mapio organynnau. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里): Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Deall y gymdogaeth: defnyddio dibyniaeth y gymdogaeth ar fywyd biolegol.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Deall agosrwydd: nodweddu cymhlygion protein a mapio organynnau gan ddefnyddio biotinyleiddiad sy'n dibynnu ar agosrwydd.Cyfredol.Fy marn i.Cemegol.bioleg 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Mapio'r microamgylchedd trwy drosglwyddo egni Dexter i gelloedd imiwnedd.Gwyddoniaeth 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Mae rhwydweithiau graddfa dau broteome yn canfod ailfodelu cell-benodol o'r rhyngweithiad dynol.Celloedd 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Amser post: Medi-15-2022
